銅綠假單胞菌PA1797基因相關(guān)功能的研究.pdf

1、目的:
　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，又稱綠膿桿菌，屬假單胞菌屬，廣泛分布于自然界、人體的皮膚、腸道和上呼吸道中，具有多重耐藥性的特點(diǎn)，其分離率在非發(fā)酵菌中居于首位。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，也是引起嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的常見病原菌之一，如中性粒細(xì)胞減少癥、嚴(yán)重?zé)齻蚰倚岳w維化，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命。隨著抗菌藥物的廣泛使用，抗菌耐藥株的不斷出現(xiàn)和傳播，使得治療方法越來越有

2、限；結(jié)果，銅綠假單胞菌感染顯示出高發(fā)病率和死亡率。因此，探討銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制，對(duì)于控制由銅綠假單胞菌引起的感染有重要的意義。
　　雙組分系統(tǒng)(two component syste m，TCS)廣泛存在于銅綠假單胞菌中，文獻(xiàn)報(bào)道在某些TCS的突變情況下，銅綠假單胞菌中的PA1797基因表達(dá)量比某些基因表達(dá)量都要大，如PA2572/PA2573，PA2572基因突變使PA1797基因升高56.2倍；CbrAB，CbrA基因突變

3、使PA1797基因升高10.37倍；而在PhoPQ和ParRS突變中PA1797基因表達(dá)量相對(duì)較小。在Pseudomonas aeruginosa基因組數(shù)據(jù)庫(www. pseudomonas.com)中，PA1797基因被定義為一個(gè)功能未知的新基因，目前有關(guān)PA1797基因的報(bào)道尚不多見，PA1797基因的功能尚不明確。本文采用抗生素敏感實(shí)驗(yàn)、綠膿素產(chǎn)量、殺菌、運(yùn)動(dòng)能力和生物膜培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)對(duì)PA1797基因的功能進(jìn)行探討。
　　方

4、法:
　?。?)PCR擴(kuò)增 PA1797同源臂與四環(huán)素抗性基因插入自殺質(zhì)粒 pEX18-Tc，構(gòu)建 PA1797基因敲除載體，利用雙親雜交轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌 PAO1，構(gòu)建PA1797基因突變株P(guān)CKH33。
　?。?)PCR擴(kuò)增PA1797－1基因編碼片段，插入pJN105質(zhì)粒阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建PA1797基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化PA1797基因突變株P(guān)CKH33，構(gòu)建PA1797基因補(bǔ)償株P(guān)CKH36。
　　

5、（3）通過抗生素敏感實(shí)驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、殺菌實(shí)驗(yàn)、綠膿素產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)，觀察野生株、突變株及補(bǔ)償株變化。
　?。?）用Trizol法抽提銅綠假單胞菌的總RNA，Real-time熒光定量PCR檢測(cè)在PA1797基因突變情況下其他相關(guān)毒力基因表達(dá)情況。
　　（5）生物膜培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色后用熒光相差顯微鏡觀察野生株、突變株及補(bǔ)償株變化。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)PCR及測(cè)序，證明銅綠假單胞菌突變株P(guān)CKH33中缺失PA1797

6、基因，成功構(gòu)建銅綠假單胞菌PA1797基因突變株P(guān)CKH33。
　?。?）經(jīng)PCR及測(cè)序，證明成功構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pJN105-PA1797-1和銅綠假單胞菌補(bǔ)償株P(guān)CKH36。
　?。?）與野生株相比較，突變株對(duì)美羅培南、頭孢他啶和喹諾酮類的抑菌圈變?。挥緞?dòng)能力有明顯區(qū)別；喪失殺菌能力；綠膿素產(chǎn)量減少。
　　（4）與野生株相比較，突變株Ⅲ型分沁系統(tǒng)中的exoS基因相對(duì)表達(dá)量明顯下降。
　　（5）與野生株相比較，突