線粒體融合蛋白2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的研究.pdf

1、肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，目前占我國(guó)惡性腫瘤死亡原因的第二位，肝癌早期往往不易發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已屬中晚期，如果不能徹底手術(shù)切除，目前仍缺乏其他有效的治療方法。通過(guò)各種手段干預(yù)腫瘤細(xì)胞的活化增殖，是目前治療肝癌的研究方向和研究熱點(diǎn)。腫瘤的形成多與失控的細(xì)胞增殖相關(guān)，而細(xì)胞凋亡在這種病態(tài)的增殖密切相關(guān)。細(xì)胞增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene，HSG)是利用差異顯示技術(shù)得到的一個(gè)與高血壓相關(guān)的新基因，最

2、近研究發(fā)現(xiàn)HSG與線粒體融合相關(guān)，因此被稱為線粒體融合蛋白2(Mfn2)。研究表明，Mfn2通過(guò)與ras基因結(jié)合，抑制Ras-Erk通路的活性，從而上調(diào)周期調(diào)控蛋白P27和P21Cipl的表達(dá)、下調(diào)PCNA的表達(dá)、阻滯細(xì)胞于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞增殖，提示Mfn2可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　第一部分線粒體融合蛋白2(Mfn2)通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡
　　目的:
　　Mfn2顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞(V

3、SMCs)增殖，并具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)。本文證實(shí)Mfn2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　運(yùn)用QRT-PRC和免疫組化分析肝癌與癌旁正常肝組織Mfn2基因與蛋白表達(dá)水平。本研究采用肝癌細(xì)胞株HepG2與Huh7細(xì)胞，運(yùn)用腺病毒載體外源性加入重組的Mfn2，建立過(guò)表達(dá)Mfn2的細(xì)胞模型。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析Mfn2對(duì)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、活性氧水平的影響，運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞色

4、素c釋放、Bax移位和活化的Caspase3表達(dá)，并探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　定量PCR和免疫組化顯示，與癌旁正常肝組織相比，癌組織中Mfn2在基因與蛋白水平均低表達(dá)(P＜0.01)。免疫組化顯示，Mfn2的低表達(dá)與腫瘤的大小及分期密切相關(guān)(P=0.038和0.040)。生存曲線表明低表達(dá)Mfn2的肝癌病人預(yù)后較差(P＜0.01)。
　　肝癌細(xì)胞株HepG2與Huh7過(guò)表達(dá)Mfn2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡、

5、線粒體膜電位(△Ψm)下降、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(ROS)增加、Bax由細(xì)胞質(zhì)易位于線粒體而細(xì)胞色素c由線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)。
　　結(jié)論:
　　Mfn2在癌組織中低表達(dá)，與腫瘤大小、分期及病人生存率密切相關(guān)。發(fā)現(xiàn)Mfn2可能通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　第二部分線粒體融合蛋白2(Mfn2)通過(guò)激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)鈣離子(Ca2+)流入線粒體從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡
　　目的:
　　Mfn2顯著抑制細(xì)胞增殖

6、并具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)。另外，Mfn2不但促進(jìn)線粒體融合并維持線粒體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且是維持線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)緊密聯(lián)系的橋梁蛋白。本研究探討Mfn2可能通過(guò)激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子流入線粒體從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　方法:
　　應(yīng)用肝癌細(xì)胞株HepG2，通過(guò)腺病毒載體外源性加入Mfn2，建立過(guò)表達(dá)Mfn2的細(xì)胞模型。運(yùn)用鈣離子示蹤劑，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體內(nèi)鈣離子的變化。另外，分別應(yīng)用藥物肝素(Heparin)（特異性抑制內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)上IP3激活的鈣離子釋放通道）和RU360（特異性阻斷線粒體鈣離子攝入）處理過(guò)表達(dá)Mfn2的細(xì)胞，分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的鈣離子流向并檢測(cè)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、活性氧水平和細(xì)胞色素c釋放。
　　結(jié)果:
　　在Mfn2的外源性處理下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)內(nèi)鈣離子下降、線粒體內(nèi)鈣離子增加。然而，運(yùn)用Heparin和RU360處理過(guò)表達(dá)Mfn2的HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不發(fā)生凋亡、線粒體膜電位(△Ψm)不下降、活性氧水平(ROS)不升高、