miR-26a誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:通過將miR-26a模擬物分別轉(zhuǎn)染不同p53及Rb1基因背景的人肝癌細(xì)胞系（p53野生型HepG2細(xì)胞、p53突變型PLC/PRF/5細(xì)胞及不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞），觀察miR-26a表達(dá)上調(diào)對三種不同人肝癌細(xì)胞凋亡水平的影響，并進(jìn)一步探討miR-26a轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　　方法:1.將15例人原發(fā)性肝癌手術(shù)切除標(biāo)本中的肝癌組織及癌旁組織分別應(yīng)用石蠟包埋組織microRNA快速提取試劑盒提

2、取miRNA分子，并利用qRT-PCR(Real TimeQuantitative，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù))對目標(biāo)miRNA分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。2.將三種不同p53及Rb1基因背景的人肝癌細(xì)胞系分別接種于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至對數(shù)生長期。3.將miR-26a模擬物(mimic)及模擬物的陰性對照(mimic negative control)分別轉(zhuǎn)染不同p53及Rb1基因背景的三種人肝癌細(xì)胞系，并

3、應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測miR-26a模擬物轉(zhuǎn)染后三種不同人肝癌細(xì)胞凋亡水平的變化。4.以細(xì)胞骨架蛋白β-actin的表達(dá)水平為內(nèi)參，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測miR-26a模擬物轉(zhuǎn)染后三種人肝癌細(xì)胞p53蛋白、p-p53（phospho-p53，磷酸化的p53蛋白）、PUMA(p53 up-regulatedmodulator of apoptosis，p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子)蛋白表達(dá)水平的變化。5.

4、再次應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測miR-26a特異性模擬物轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞及PLC/PRF/5細(xì)胞中Rb1蛋白表達(dá)水平的變化，并根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，構(gòu)建含有miR-26a結(jié)合位點(diǎn)Rb13' UTR片段的熒光素酶報(bào)告基因載體(pMIR-Rb1-3'UTR)及其突變型報(bào)告基因載體（pMIR-mut-Rb1-3’ UTR）進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。6.應(yīng)用免疫共沉淀法檢測miR-26a轉(zhuǎn)染后p53野生型HepG2細(xì)胞內(nèi)與E2

5、F1結(jié)合Rb1蛋白水平的變化，并應(yīng)用Western blot檢測游離E2F1蛋白的水平。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。
　　結(jié)果:1.在15例人原發(fā)性肝癌手術(shù)切除標(biāo)本中，肝癌組織miR-26a的表達(dá)水平較癌旁組織顯著降低。2.通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物，三種人肝癌細(xì)胞miR-26a的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物的陰性對照，對肝癌細(xì)胞miR-

6、26a的表達(dá)無明顯影響。3.三種人肝癌細(xì)胞中，僅p53野生型HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后其凋亡水平顯著增加，p53突變型的PLC/PRF/5細(xì)胞及不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后，其凋亡水平均未發(fā)生明顯變化。4.p53野生型HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a后，p53蛋白的表達(dá)水平及其磷酸化水平(p-p53)均明顯增加，且p53野生型HepG2細(xì)胞的凋亡調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄靶基因PUMA的表達(dá)水平也

7、明顯上調(diào)。而p53突變型的PLC/PRF/5細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后，p53蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但p-p53及PUMA蛋白表達(dá)水平均未見顯著變化;不表達(dá)p53和Rb1基因的Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后，p53、p-p53及PUMA蛋白表達(dá)水平均未發(fā)生顯著變化。5.miR-26a通過與Rb13' UTR靶位點(diǎn)的特異結(jié)合抑制Rb1的表達(dá)。p53野生型HepG2細(xì)胞和p53突變型PLC/PRF/5細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物使

8、其miR-26a表達(dá)水平上調(diào)后，其Rb1蛋白的表達(dá)水平均明顯降低。6.轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物后，p53野生型HepG2細(xì)胞內(nèi)與E2F1結(jié)合Rb1蛋白水平顯著降低，而E2F1蛋白水平則顯著增加。
　　結(jié)論:作為抑癌基因，miR-26a在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，上調(diào)miR-26a的表達(dá)水平，可使p53野生型HepG2細(xì)胞的凋亡水平顯著增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，miR-26a可以直接調(diào)控Rb1的表達(dá)，miR-26a轉(zhuǎn)