反義端粒酶RNA基因誘導(dǎo)人肝癌細胞Bel-7402凋亡的分子機制研究.pdf

1、目的：從細胞生物學(xué)水平觀察肝癌細胞凋亡相關(guān)因子在反義端粒酶RNA基因誘導(dǎo)人肝癌細胞株Bel-7402凋亡過程中的變化。初步探討逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的反義端粒酶RNA基因誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的分子機制，從而為臨床治療肝癌提供理論依據(jù)。
　　 方法：本課題組前期實驗已通過質(zhì)粒構(gòu)建-電穿孔法導(dǎo)入包裝細胞-重組病毒感染肝癌細胞株三個步驟篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的肝癌細胞克隆。體外培養(yǎng)肝癌細胞株Be1-7402以及分別轉(zhuǎn)染正、反義端粒酶RNA基因組

2、的肝癌細胞Bel-7402-hTR-EcoRI和Bel-7402-hTR-BamHI。利用PCR法檢測目的基因的插入；Hochest33258染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。采用實時熒光定量PCR法和Western Blot法分別檢測凋亡相關(guān)基因p53、Bc1-2和Bax mRNA和蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1PCR鑒定可于約500bp處檢測到目的基因的表達，證明目的基因在肝癌細胞中持續(xù)表達。

3、　　 2反義端粒酶RNA轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞，Hochest33258熒光染色發(fā)現(xiàn)部分細胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮，呈致密亮藍色熒光，部分細胞出現(xiàn)凋亡特征性改變，染色質(zhì)分布不均，形成熒光斑點。
　　 3實時熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)反義轉(zhuǎn)染組肝癌細胞的p53mRNA和BaxmRNA表達顯著高于正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組(P<0.05)，Bcl-2mRNA表達則顯著低于正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組(P<0.05)。正義轉(zhuǎn)染組和空白對照組間各基因表達無明顯

4、差異(P>0.05)。
　　 4Western Blot結(jié)果顯示反義端粒酶RNA使Bel-7402細胞p53、Bax蛋白表達量明顯升高(P<0.01)，且能明顯降低Bcl-2蛋白表達水平(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1應(yīng)用Hochest33258熒光染色法能快速觀察肝癌Be-17402細胞凋亡細胞核變化的情況。
　　 2反義端粒酶RNA誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的過程中伴隨著p53、Bax基因的表達量增加