人參皂甙Rg3逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞BEL-7402多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的:原發(fā)性肝細(xì)胞癌（以下簡稱原發(fā)性肝癌,HCC）居世界上最常見的癌癥中的第五位，每年造成50萬人死亡。盡管肝癌標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）檢測的開展及影像學(xué)的發(fā)展使許多亞臨床肝癌或小肝癌得以檢出，并行手術(shù)治療，大部分肝癌檢出時已屬于晚期且合并肝硬化，對這些病人需采用包括手術(shù)在內(nèi)的綜合治療，其中化療特別是局部灌注占有重要地位，但化療效果并不不理想。近來研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞抗藥性與多藥耐藥基因（MDR）的過度表達(dá)有關(guān)，研究肝癌多藥耐藥

2、（MDR）機(jī)制及尋求克服多藥耐藥方法成為腫瘤研究中的熱門課題。多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細(xì)胞接觸某一種化療藥物，不僅對此種藥物產(chǎn)生抗藥性，而且還可對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的原因之一，目前發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物由于毒副作用大而限制了其臨床應(yīng)用，因此，從天然植物中提取毒副作用較小的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的藥物，逐漸成為一個密切關(guān)注的新領(lǐng)域。人參皂甙Rg3（GRg3）是從人參中提取的單體成分，具

3、有較低的毒副作用。多項(xiàng)研究已證實(shí)人參皂甙Rg3具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并對化療具有增效減毒作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選用具有天然耐藥性的肝癌細(xì)胞BEL-7402為實(shí)驗(yàn)對象，探討人參皂甙Rg3對BEL-7402的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，并進(jìn)一步探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，為臨床耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)和研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。 方法: （1）采用MTT法（四唑藍(lán)比色法）檢測經(jīng)不同濃度的人參皂甙Rg3處理過的人肝癌細(xì)胞株

4、BEL-7402的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，并繪制隨藥物濃度變化的細(xì)胞生長抑制曲線；計(jì)算出該藥的半抑制濃度IC50，為下一步實(shí)驗(yàn)提供合適的藥物濃度。 （2）人參皂甙Rg3逆轉(zhuǎn)BEL-7402耐藥的作用研究：不同濃度人參皂甙Rg3單獨(dú)及聯(lián)合長春新堿（VCR），逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米（VRP）聯(lián)合VCR處理肝癌細(xì)胞BEL-7402，通過測定BEL-7402細(xì)胞的吸光度值（OD值）變化，計(jì)算出逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。 （3）人參皂甙R

5、g3（40．0μg/mL）對人肝癌BEL-7402細(xì)胞作用72h后，免疫組織化學(xué)方法檢測P-糖蛋白（P-gp），多藥抗藥性相關(guān)蛋白（MRP）蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)變化。 （4）人參皂甙Rg3（40．0μg/mL）對人肝癌BEL-7402細(xì)胞作用不同時間（24h，48h，72h）后，分別采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測MDR1 mRNA表達(dá)變化，研究人參皂甙Rg3逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞BEL-7402耐藥的機(jī)制。 結(jié)果

6、: （1）不同濃度的人參皂甙Rg3均可抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞株的生長，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著人參皂甙Rg3濃度增大，時間的延長，其對細(xì)胞的生長抑制率顯著增加，呈明顯的時效－量效關(guān)系。從抑制生長曲線中算出人參皂甙Rg3作用72h的半抑制濃度（IC50）為66．9μg/mL； （2）實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度的人參皂甙Rg3與長春新堿（VCR）聯(lián)合作用后，其對細(xì)胞增殖抑制率較單獨(dú)用藥時增加，CDI<1，提示兩者聯(lián)合具有協(xié)同抑

7、制腫瘤細(xì)胞生長的作用。并且發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3<40．0μg/mL與VCR聯(lián)合作用于肝癌BEL-7402細(xì)胞作用不明顯，人參皂甙Rg3>40．0μg/mL時與VCR聯(lián)合作用于肝癌BEL-7402細(xì)胞作用有顯著性，因此取40．0μg/mL人參皂甙Rg3為逆轉(zhuǎn)濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 （3）人參皂甙Rg340．0μg/mL作用于肝癌細(xì)胞BEL-7402后72小時的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)是6．27，已知逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米（VRP）的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)是11．1

8、8。 （4）人參皂甙Rg3能抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)水平，與對照組比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而人肝癌BEL-7402細(xì)胞多藥抗藥性相關(guān)蛋白（MRP）蛋白表達(dá)無明顯變化。 （5）逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg340．0μg/mL作用于肝癌細(xì)胞BEL-7402后不同時間（24h、48h、72h）MDR1 mRNA的表達(dá)量明顯下降，與對照組比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論:

9、 1．體外實(shí)驗(yàn)表明，人參皂甙Rg3可抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖，并具有明顯的時效－量效關(guān)系。 2．人參皂甙Rg3與長春新堿（VCR）聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制作用，能逆轉(zhuǎn)BEL-7402對VCR的耐藥。 3．免疫組織化學(xué)法（SABC）檢測，人參皂甙Rg3可抑制BEL-7402細(xì)胞膜P糖蛋白的表達(dá)作用，對MRP的表達(dá)無明顯影響。 4．逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg3能抑制BEL-74