家蠶小熱激蛋白19.9及其n末端缺失體的原核表達和分子伴侶功能研究

1、浙江理工大學碩士學位論文家蠶小熱激蛋白19.9及其N末端缺失體的原核表達和分子伴侶功能研究姓名：王麗燕申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：張耀洲20100301浙江理T 大學碩士學位論文A b s t r a c tT h e s m a l lh e a ts h o c k p r o t e i n s ( s H s p s ) a r es t r e s s - i n d u c i b l em o l

2、 e c u l a rc h a p e r o n e st h a tr a n g ei ns i z ef r o m 12t o4 3k D a ．A l t h o u g h t h es H s p sf a m i l y v a r y g r e a t l yi ns e q u e n c ea n ds i z e ，b u tt h e r ea r es e v e r a l c o m m o ns

3、 t r u c t u r ef e a t u r e s ：1 ，0 【一c r y s t a l l i n d o m a i nc o m p o s e do fa p p r o x i m a t e l y9 0a m i n oa c i dr e s i d u e s ；2 ，t h ec o n t e n to fC y sl o w e rt h a no t h e rp r o t e i nf a

4、 m i l y ；3 ，f o r m i n gl a r g eo l i g o m e r s w i t h ad y n a m i cf o u r s t r u c t u r e ；4 ，t h e m o l e c u l a r c h a p e r o n ea c t i v i t y o fi n h i b i t i n gp r o t e i n a g g r e g a t i o n

5、．O u re x p e r i m e n ts e l e c t e ds H s p l 9 ．9w h i c h h a sb e e nf o u n da st h es m a l l e s ts H s pi n B o m b y xm o r i ．B yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，w ec o n s t r u c t e dt h r e ep

6、 E T - 2 8 a e x p r e s s i o nv e c t o r sr e s p e c t i v e l yi n s e r t e dw i t hf u l l —l e n g t ha n dt w ot r u n c a t i o nm u t a n t so f d e l e t i n g1 ·2 4a n d1 —6 2N —t e r m i n a la m i n o

7、a c i d sr e s i d u e s ．T h e yw e r et r a n s f o r m e d i n t oE ．c o l iB L 2 1 一S t a rt oe x p r e s s i n c l u s i o nb o d i e sw h i c hw e r e p u r i f i e dw i t hm e t a la f f i n i t yc h r o m a t o g

8、 r a p h ya n d r e f o l d e dw i t hS e p h e d e x G 一1 5 0g e lc o l u m n ．P o l y c l o n a la n t i b o d yw a s g e n e r a t e db yi m m u n i n g a N e w Z e a l a n dm a l er a b b i tw i Ⅱlr e c o m b i n a n

9、 ts H s p 19 ．9 一F L p r o t e i n a n dt h e t i t e r W a s o v e r 1 “ 12 8 0 0 ，m e a s u r e db yE L I S A ．A c c o r d i n gt oS D S - P A G E ( r e d u c e da n dn o n - r e d u c e d ) a n dW e s t e mb l o t ，s

10、H s p 19 ．9 - F L ，s H s p 19 ．9 一△1 a n ds H s p l 9 ．9 - A 2 a l l f o r m e dd i m e r st h r o u g h i n t r a m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s ．A c c o r d i n g l y , t h ee x p e r i m e n ta n a l y

11、z e dt h a t t h e yw e r e a l l d e g r a d e db yt r y p s i ns e n s i t i v i t ye x p e r i m e n t ，i n d i c a t i n gt h a tn o n eo f t h et h r e ep r o t e i n sf o r m e ds t a b l es t r u c t u r eo f l a

12、r g eo l i g o m e r s ．W h i l et h em o l e c u l a rc h a p e r o n e a c t i v i t y b y c i t r a t e s y n t h a s e ( C S ) t h e r m a l a g g r e g a t i o n e x p e r i m e n t s a n d t h eD T T - i n d u c e

13、dl y s o z y m e a g g r e g a t i o n , w e c o n f i r m e d t h a t t h e o b t a i n e d s H s p l 9 ．9 一F L p r o t e i np o s s e s s e d t h em o l e c u l a rc h a p e r o n e f u n c t i o n ，b u to t h e r sd i

14、 d n ’t ．T h ee x p e r i m e n tr e s u l t s g i v em o r ei n f o r m a t i o n a b o u tt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e s t r u c t u r e a n df u n c t i o n o fs m a l l h e a t s h o c kp r o t e

15、i n sf r o mt h es i l k w o r m ．T h r o u g ha n a l y s i so f W e s t e r n b l o ta n d s e m i —q u a n t i t a t i v eE L I S A ，t h es t r e s se x p r e s s i o no f t h es p i n n i n g s i l k w o r ma n dp u

16、p aw e r e d i f f e r e n t ，w h i c hw e r ei n c u b a t e da t r o o mt e m p e r a t u r ef o rd i f f e r e n tp e r i o d a f t e r h e a t t r e a t m e n t ．H o w e v e r , t h ee x p r e s s i o n l e v e l a f

17、 t e rh e a t t r e a t m e n tW a sh i g h e rt h a n b e f o r e ．T h e t o t a lR N A a n d p r o t e i ni ns e v e r a lt i s s u e s o f t h ef i f t hi n s t a rs i l k w o r mw e r ee x t r a c t e d ，a n dt h ee