杧果小分子熱激蛋白基因的克隆及其逆境脅迫下的功能分析.pdf

1、杧果(Mangifera indica Linn)屬于漆樹科杧果屬常綠植物，是世界上五大熱帶水果之一。近年來由于全球氣候不斷變化，地球溫度不斷升高，導(dǎo)致多種非生物脅迫對(duì)杧果的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響，給杧果產(chǎn)量、品質(zhì)以及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到較大影響。目前，高溫對(duì)于杧果果實(shí)采后貯藏保鮮的生理生化影響研究較多，但高溫脅迫對(duì)杧果幼苗生理生化的影響未見報(bào)道，為此，本研究以土杧砧木的一年生盆栽四季杧與臺(tái)農(nóng)1號(hào)杧品種嫁接苗為材料，進(jìn)行44℃高溫處理，采集處理

2、不同時(shí)間的樣品，比較分析這二個(gè)品種的生理生化特性。另一方面，本實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)杧果在鹽脅迫、干旱等逆境脅迫處理下cDNA差異表達(dá)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有三個(gè)小分子熱激蛋白基因高度表達(dá)響應(yīng)了非生物脅迫，尤其是高溫脅迫的基因片段，為了弄清這3個(gè)基因的功能，本研究進(jìn)一步克隆其cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討三個(gè)小分子熱激蛋白基因在四季杧中的表達(dá)模式，并將其轉(zhuǎn)化擬南芥和大腸桿菌中進(jìn)行功能分析，為杧果逆境脅迫的深入研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　1.杧果幼苗在高溫脅迫下生理特性的變化
　　在高溫脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，兩個(gè)杧果品種細(xì)胞膜質(zhì)的丙二醛(MDA)和電導(dǎo)率指標(biāo)均出現(xiàn)上升趨勢(shì)。四季杧品種的SOD酶活性各個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照，臺(tái)農(nóng)1號(hào)杧的SOD先上升后下降，兩者的CAT酶活性均下降。滲透物質(zhì)的脯氨酸含量先上升后下降，可溶性蛋白、可溶性糖含量均上升，電導(dǎo)率和相對(duì)含水量下降。不同品種生理生化指標(biāo)的變化幅度不一致，經(jīng)比較分析推測(cè)杧果臺(tái)農(nóng)1號(hào)杧品種耐熱性比四季杧

4、品種較強(qiáng)。
　　1.MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2基因克隆與表達(dá)分析
　　根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得的3個(gè)小分子熱激蛋白基因cDNA部分序列，采用cDNA全長(zhǎng)克隆技術(shù)，利用杧果品種中性狀特別的四季杧不同組織為材料，成功克隆了杧果的三個(gè)小分子熱激蛋白MiHSP17.6、MiHSP17.7、MiHSP23.2基因cDNA全長(zhǎng)，三個(gè)基因序列長(zhǎng)度分別為680、720和870 bp，包含完整開放閱讀框分別為46

5、2、465和615 bp，分別編碼144、145和205個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量大小分別為17.6、17.7和23.2 kD，理論等電點(diǎn)分別為5.8、5.7和5.2。經(jīng)Blast比對(duì)和蛋白同源性分析，三個(gè)蛋白基因均具有小分子熱激蛋白的結(jié)構(gòu)特征，將該3個(gè)基因命名分別為MiHSP17.6、MiHSP17.7、MiHSP23.2，Genbank登錄號(hào)為KJ459857、KJ459858和KJ459859。通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)MiHSP17.6

6、與MiHSP17.7均屬于細(xì)胞質(zhì)ClassⅠ家族成員，MiHSP23.2為線粒體家族成員，同源性比較表明，三個(gè)小分子熱激蛋白均與可可、棉花、甜橙等植物具有80～82％的相似性。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析表達(dá)模式，結(jié)果顯示:三個(gè)小分子熱激蛋白基因在葉（嫩葉與老葉）、莖（嫩莖與老莖）、花均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高:在果實(shí)形成和發(fā)育初期，MiHSP17.6與MiHSP17.7表達(dá)量略有下降，MiHSP23.2出現(xiàn)上升后下降，但在果實(shí)成熟

7、期前，三者的表達(dá)量均明顯上升;在不同逆境脅迫(高溫、低溫、鹽(NaCl)、干旱(PEG)處理和不同的信號(hào)物質(zhì)(ABA、H2O2和SA)刺激下，三個(gè)基因均被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2.MiHSP17.6與MiHSP17.7原核表達(dá)與功能分析
　　首先獲得了MiHSP17.6與MiHSP17.7兩個(gè)基因的融合表達(dá)載體(采用pET-28a)，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，在經(jīng)誘導(dǎo)后獲得大量重組蛋白，之后對(duì)其進(jìn)行純化，通過利用SDS

8、-PAGE和Western blot技術(shù)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明上述結(jié)果正確，重組蛋白都可以與抗6-His標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)。pET-HSP17.7與pET-MiHSP17.6兩個(gè)大腸桿菌經(jīng)蛋白誘導(dǎo)后，對(duì)52℃高溫脅迫均沒有表達(dá)，對(duì)4℃與-20℃低溫脅迫耐冷性明顯高于對(duì)照。pET-MiHSP17.7蛋白誘導(dǎo)后耐鹽性明顯高于僅轉(zhuǎn)化pET-28a對(duì)照，而pET-MiHSP17.6的耐鹽性低于對(duì)照。在脅迫初期（2h內(nèi)），兩其

9、的耐旱性均高于對(duì)照，但在中、后期兩個(gè)蛋白基因的耐旱性明顯低于對(duì)照。
　　3.MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2真核表達(dá)與功能驗(yàn)證
　　將MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2三個(gè)基因片段，分別構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pB121上，轉(zhuǎn)化擬南芥并用Kan、GUS組織化學(xué)法和PCR篩選，獲得轉(zhuǎn)基因后代MiHSP17.6的5株、MiHSP17.7的35株和MiHSP23.2的5株。將T3代轉(zhuǎn)