家蠶細(xì)胞周期蛋白Cyclin B3基因的克隆及其功能研究.pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，更是經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。作為真核生物，家蠶生物反應(yīng)器有著原核生物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，利用家蠶生產(chǎn)具有特異性或經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的蛋白質(zhì)，已成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)。家蠶大規(guī)模EST測(cè)序和基因組框架圖的相繼完成，不僅對(duì)蠶業(yè)科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重大意義，而且對(duì)于整個(gè)生命科學(xué)的研究也具有重要的促進(jìn)作用，目前的主要工作是對(duì)家蠶基因組中的大量基因進(jìn)行研究，以探索其具體的生物學(xué)功能。 CyclinB3和CyclinB兩種周期

2、蛋白是G2期向M期轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子，家蠶絲腺組織內(nèi)的絲腺細(xì)胞只進(jìn)行核內(nèi)有絲分裂，細(xì)胞周期只進(jìn)行GI期向S期的轉(zhuǎn)換。本論文主要由進(jìn)行了家蠶細(xì)胞周期蛋白CyclinB3基因的克隆和家蠶細(xì)胞周期蛋白CyclinB3與CyclinB基因的功能研究,獲得的研究結(jié)果如下： (1)家蠶細(xì)胞周期蛋白CyclinB3基因的克隆及序列分析利用家蠶EST數(shù)據(jù)，根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)引物，體外克隆該基因的編碼區(qū)序列，包含ORF全長(zhǎng)的CyclinB3基因。該

3、基因全長(zhǎng)1665bp，ORF長(zhǎng)1536bp，由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼511個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量57.SkDa，等電點(diǎn)為9.18。CyclinB3基因含有一個(gè)蛋白破壞框，并且位于第75個(gè)aa到第84個(gè)aa之間。用在線SMART程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，表明CyclinB3基因在第288個(gè)aa到第379個(gè)aa之間和第392個(gè)aa到第473個(gè)aa之間各含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，又稱周期蛋白框。通過NCBI的Blast程序進(jìn)行在線蛋白質(zhì)序列比對(duì)分

4、析表明，家蠶CyclinB3的碳末端保守結(jié)構(gòu)域與果蠅的保守結(jié)構(gòu)域蛋白相似。 (2)家蠶細(xì)胞周期蛋白CyclinB3和CyclinB基因的功能研究利用細(xì)胞的RNAi技術(shù)，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)dsRNA，轉(zhuǎn)染BmN-SWU1，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：dsRNA-CyclinB3、dsRNA-CyclinB和dsRNA-CyclinB3/B分別轉(zhuǎn)染卵巢細(xì)胞48h后，細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為63.65％、65.43％和69.56％。實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞干涉后，dsRNA轉(zhuǎn)染能下調(diào)CyclinB3和CyclinB基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：dsRNA-CyclinB3/B、dsRNA-CyclinB和dsPOVA-CyclinB3分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，對(duì)卵巢細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為51.79±2.40％、45.22±2.02％和38.33±1.47％，均有顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞干涉后，dsRNA轉(zhuǎn)染能下調(diào)CyclinB