Cyclin B1反義全長cDNA誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及抑制成瘤性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的：細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)為有絲分裂期(M期)細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK1)結(jié)合形成成熟促進(jìn)因子(muturiorpromotingfactor,MPF)，MPF的激活為真核細(xì)胞啟動(dòng)有絲分裂所必需，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；CyclinB1在許多腫瘤細(xì)胞系均高表達(dá)，其高表達(dá)被視為腫瘤具有惡性潛能的標(biāo)志之一。反義cDNA是反義技術(shù)中一種簡便有效

2、的下調(diào)靶基因的方法，但目前尚未見應(yīng)用該方法靶向CyclinB1基因抗腫瘤治療的相關(guān)報(bào)道。 方法：構(gòu)建含有小鼠CyclinB1反義全長cDNA的重組質(zhì)粒(pAS-mCLB1)并將pAS-mCLB1及空載體pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌(LL/2)和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞系(CT26)，建立了AS-mCLB1及pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(Ac及Pc細(xì)胞)；通過流式細(xì)胞儀檢測Ac、Pc及未經(jīng)轉(zhuǎn)染(Nc)細(xì)胞的細(xì)胞周

3、期分布及凋亡；分別用兩步法半定量RT-PCR及Westernblot比較上述三種細(xì)胞中mCyclinB1的mRNA及蛋白含量；MTT及細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞增殖活性；在小鼠體內(nèi)分別接種上述三種細(xì)胞，觀察細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性及荷瘤小鼠的生存時(shí)間；然后對(duì)Ac與Nc組的細(xì)胞及動(dòng)物血清進(jìn)行蛋白組學(xué)差異分析；免疫組化檢測Ac、Pc及Nc組動(dòng)物腫瘤組織mCyclinB1的蛋白表達(dá)，凋亡染色了解腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：Ac細(xì)胞與兩對(duì)照(

4、Nc及Pc)細(xì)胞相比，mCyclinB1的mRNA及蛋白含量顯著下降，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡、G1期阻滯及異常的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞增殖也受到明顯抑制。另外，接種LL/2/Ac細(xì)胞的C57BL/6小鼠在接種后第9天成瘤，而兩對(duì)照組第5天就已成瘤；同樣，接種CT26/Ac細(xì)胞的BALB/C小鼠在接種后第6天成瘤，而兩對(duì)照組第3天就已成瘤。而且，兩種腫瘤模型Ac組的生存時(shí)間均較其對(duì)應(yīng)的兩對(duì)照組顯著延長。無論是細(xì)胞還是動(dòng)物血清，在Ac及Nc組之間蛋白組

5、學(xué)均存在顯著差異。免疫組化染色提示Ac組腫瘤組織中mCyclinB1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，凋亡染色顯示該組腫瘤組織細(xì)胞凋亡率增加。 結(jié)論：本研究首次報(bào)道了用AS-CLB1靶向腫瘤細(xì)胞的CyclinB1基因，闡明了該基因活性下調(diào)的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，證實(shí)了AS-CLB1通過降低腫瘤細(xì)胞CyclinB1基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯及凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外增殖活性的高效性，為抗腫瘤生物治療提供了一條極有潛力的新策略。