蜂毒素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞周期阻滯及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究目的及背景：
　　 原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有早期診斷難，治療手段少，病程進(jìn)展快，病死率高等特點(diǎn)，被稱為“癌中之王”，給全社會(huì)帶來(lái)了沉重的疾病負(fù)擔(dān)和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前肝癌最有效的治療手段是早期手術(shù)切除，但在我國(guó)大部分病人初次診斷時(shí)就已進(jìn)入中晚期，且多伴嚴(yán)重肝硬化和肝功能異常，使手術(shù)治療受到極大限制。即便是成功實(shí)施手術(shù)切除的早期病人，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率也很高，嚴(yán)重影響了患者的生存和總體治療效果。此外，放療、介

2、入治療和肝移植等治療方法雖然取得一定進(jìn)展，但總體療效仍然不能令人滿意。這一方面可能與肝癌細(xì)胞的多藥耐藥基因有關(guān)，更重要的原因是肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素的過(guò)程，涉及到細(xì)胞內(nèi)的一系列復(fù)雜的生物學(xué)變化。因而從理論上就可以判斷，僅僅針對(duì)單一環(huán)節(jié)的藥物或治療不可能取得理想的治療效果。即便是代表學(xué)科前沿方向的靶向治療藥物，因其作用機(jī)制靶向性過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致臨床適應(yīng)人群少，且極易出現(xiàn)藥物耐藥和毒副反應(yīng)，并未取得預(yù)期中的良好療效。因此，研發(fā)針對(duì)腫瘤發(fā)

3、生、發(fā)展多個(gè)環(huán)節(jié)的藥物或者研究多種不同機(jī)制的藥物聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng)新療法成為學(xué)科發(fā)展的一個(gè)重要方向。目前，抗腫瘤藥物常見(jiàn)機(jī)制包括抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡和壞死，誘導(dǎo)分化等。遺憾的是，目前常用的抗肝癌藥物中，多數(shù)抗瘤效果單一，療效并不明顯。因此，研發(fā)具有多重抗瘤功能的新藥，或者探索多藥聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng)新療法對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)肝癌的高發(fā)國(guó)度而言，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷

4、的整個(gè)過(guò)程，通常分為G1、S、G2和M期四個(gè)時(shí)相。細(xì)胞周期中每一事件都是有規(guī)律、精確地發(fā)生，并且在時(shí)間與空間上受到嚴(yán)格調(diào)控，該調(diào)控效應(yīng)對(duì)基因損傷的及時(shí)修復(fù)和抑制細(xì)胞的惡性增殖有重要意義。細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)兩大家族基因控制著細(xì)胞周期的進(jìn)展。Cyclin通過(guò)與相應(yīng)CDK結(jié)合而激發(fā)后者的激酶活性，被活化的CDK磷酸化細(xì)胞周期相關(guān)底物，推動(dòng)周期的進(jìn)展。例如，Cyclin E-CDK2復(fù)合物推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入

5、S期，Cyclin B-CDK1復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。CDK受其抑制物CKI(CDK inhibitory protein)的負(fù)向調(diào)節(jié)。CKI包括Cip/kip和INK4a/ARF兩大基因家族，它們因能夠抑制腫瘤細(xì)胞惡性增值而被認(rèn)為是抑癌基因。Cip/kip家族包括p21，p27和p57，它們通過(guò)與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合使其失活，p21通常由抑癌基因p53激活，而p27由一種生長(zhǎng)抑制因子TGFβ激活；INK4a/ARF包括p1

6、6INK4a和p14ARF，前者能夠與CDK4結(jié)合而抑制其活性，后者能夠防止抑癌基因p53降解。CDK、Cyclin和CKI構(gòu)成了細(xì)胞周期調(diào)控的核心機(jī)制。
　　 近年來(lái)，細(xì)胞周期異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究的關(guān)注。研究表明，細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡均具有一定程度的細(xì)胞周期依賴性，幾乎所有的腫瘤都有細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控、分化受阻、凋亡異常的特征。鑒于細(xì)胞周期異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，

7、國(guó)外有學(xué)者曾提出腫瘤是一種“細(xì)胞周期性疾病”的概念。因此，調(diào)節(jié)和干預(yù)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，阻滯其生長(zhǎng)是目前腫瘤治療的重要策略之一。研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞Cyclin的表達(dá)，上調(diào)CKI表達(dá)，均可選擇性的抑制腫瘤組織CDK的活性，阻止腫瘤細(xì)胞的異常增殖。因而，探索能夠特異性抑制腫瘤細(xì)胞周期的藥物是腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在這一領(lǐng)域，我國(guó)豐富的中醫(yī)藥資源能夠給我們提供廣闊的研究空間，很多中藥都已被證實(shí)具有抗腫瘤和細(xì)胞周期阻滯作用，但其詳細(xì)的

8、分子機(jī)制和作用機(jī)理缺乏深入翔實(shí)的探討和闡述。因此，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從細(xì)胞周期阻滯角度探索抗腫瘤中藥的作用機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 在本科室以往工作的基礎(chǔ)上，我們選擇蜂毒的有效活性成分蜂毒素單體作為研究對(duì)象。蜂毒素(melittin)是蜂毒的主要活性成分，約占蜂毒干質(zhì)量的50％。蜂毒素單體是經(jīng)現(xiàn)代工藝從蜂毒中提取的有效活性成分，純度可達(dá)99％以上。它是由26個(gè)氨基酸組成的堿性多肽，其N端和C端分別具有疏水和親

9、水的生化基團(tuán)，具有典型的兩性分子結(jié)構(gòu)，具有很好的水溶性。近年來(lái)隨著蜂毒分離、提取、純化技術(shù)的不斷提高，對(duì)蜂毒素的功能及作用機(jī)制的研究也日益廣泛。目前的研究主要集中在蜂毒素的抗炎作用上，有研究表明蜂毒素能夠通過(guò)與NF-kB上游的IkB作用從而抑制NF-kB的活性發(fā)揮抗炎作用；也有報(bào)道認(rèn)為蜂毒素能夠通過(guò)與NF-kB的P50亞基相互作用從而起到抗炎效應(yīng)；蜂毒素對(duì)體內(nèi)外支原體和衣原體引起的感染也均有抑制作用。我們以前的研究結(jié)果證明，攜帶蜂毒素的

10、重組腺病毒在體外能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；蜂毒素單體能夠抑制腫瘤組織血管生成，且可通過(guò)調(diào)節(jié)Rac1依賴的信號(hào)通路來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究也表明蜂毒素單體對(duì)人肝癌細(xì)胞具有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，且能促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)不敏感肝癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，相比于單獨(dú)的蜂毒素處理組和TRAIL處理組均有顯著差異。以上研究表明，蜂毒素具有比較廣泛的抗瘤活性，其抗瘤機(jī)制包括誘導(dǎo)凋亡、抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們還觀察到蜂毒素在較低濃度下

11、也能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)我們并沒(méi)有觀察到明顯的細(xì)胞凋亡或者壞死現(xiàn)象。我們利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)低濃度蜂毒素刺激后人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)蜂毒素能阻滯肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展，經(jīng)蜂毒素刺激后人肝癌細(xì)胞S期比例明顯增加。但是，蜂毒素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，該阻滯效應(yīng)與蜂毒素抗瘤效應(yīng)的關(guān)系也未明晰。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)本課題的主要研究目的為：1.觀察蜂毒素在較低濃度下對(duì)肝癌細(xì)胞有無(wú)周期阻滯效應(yīng)；2.探索蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞周期阻滯效

12、應(yīng)的分子機(jī)制及其與抗瘤效應(yīng)的關(guān)系。
　　 二、研究方法：
　　 1、MTT法觀察較低濃度下，蜂毒素對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)蜂毒素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞周期阻滯效應(yīng)及其劑量關(guān)系；
　　 3、Western-blot檢測(cè)蜂毒素刺激后參與細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)基因在蛋白水平表達(dá)的改變情況，初步探討蜂毒素誘導(dǎo)周期阻滯的分子機(jī)制。
　　 三、研究結(jié)果：
　　 (一)MTT法觀察到蜂

13、毒素在較低濃度下(0.5-5.0ug/m1)對(duì)多種肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)有生長(zhǎng)抑制作用。當(dāng)藥物濃度達(dá)到5ug/ml、作用時(shí)間為24h，蜂毒素對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制均達(dá)到30％以上，且鏡下未觀察到明顯細(xì)胞壞死現(xiàn)象；
　　 (二)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)蜂毒素能夠誘導(dǎo)多種人肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)S期阻滯。當(dāng)藥物濃度達(dá)到5ug/ml、作用時(shí)間為48h，三種細(xì)胞S期比例均上升10個(gè)

14、百分點(diǎn)以上，且未觀察到明顯的細(xì)胞凋亡峰；
　　 (三)Western-Blot技術(shù)檢測(cè)蜂毒素刺激細(xì)胞30分鐘后，P53、P21、Rb蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變，CyclinE、CDK2表達(dá)也無(wú)明顯改變，CyclinA、CyclinD1表達(dá)減少，P27表達(dá)增加。已知CyclinA和CyclinD1是細(xì)胞周期進(jìn)展的正向調(diào)控因子，尤其是前者是細(xì)胞順利通過(guò)S期必須的周期蛋白，在該期其表達(dá)水平達(dá)到峰值。同時(shí)，P27因能夠與Cyclin-CDK復(fù)合