冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的:膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，早期診斷困難，惡性程度較高，易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。由于缺乏特異的臨床癥狀及體征，大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。患者預(yù)后不理想的主要原因是由于術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，且腫瘤對(duì)目前常規(guī)放化療方法不敏感。因此，亟需探索治療膽囊癌的新手段。冬凌草甲素是從冬凌草等植物中提取出來的一種二萜類天然活性物質(zhì)，具有抗炎、抗DNA突變、抗氧化作用。目前研究表明，冬凌草甲素對(duì)多種惡性腫瘤都有促

2、凋亡作用。因此，本課題旨在探討冬凌草甲素在體內(nèi)及體外對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及其機(jī)制，為膽囊癌化療探索新途徑。
　　方法:1.冬凌草甲素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯
　　通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖影響;利用流式細(xì)胞儀及Hoechst33342染色分析冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素在體內(nèi)對(duì)膽囊癌細(xì)胞的增殖及凋亡影響。
　　2.冬凌草甲

3、素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制
　　通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位、Caspase活性實(shí)驗(yàn)探討冬凌草甲素誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制;采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素作用后，膽囊癌細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　3.冬凌草甲素通過調(diào)節(jié)HER2基因表達(dá)誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡
　　通過Real-Time PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)冬凌草甲素作用后，膽囊癌細(xì)胞中HER2基因在mRNA

4、及蛋白水平的表達(dá)情況;構(gòu)建HER2過表達(dá)質(zhì)粒，通過流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白改變情況。收集77例膽囊癌患者及70例膽囊炎患者手術(shù)切片及臨床病理資料，通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組HER2陽性率，與反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析，探討HER2過表達(dá)與膽囊癌患者臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:冬凌草甲素對(duì)膽囊癌細(xì)胞有明顯的殺傷效果，且冬凌草甲素濃度越高，孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，其殺傷作用就越顯著

5、，呈劑量、時(shí)間依賴性。隨著冬凌草甲素作用濃度增加，膽囊癌細(xì)胞早期凋亡率明顯增加，同時(shí)其晚期凋亡率上升更為顯著，出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)改變;同時(shí)細(xì)胞線粒體膜電位降低、線粒體完整性被破壞，細(xì)胞內(nèi)的caspase-3，-9活性上升，而caspase-8活性無明顯改變;在蛋白水平，NF-κB表達(dá)下降，胞質(zhì)中Bax/Bcl-2比例上升，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向胞質(zhì)釋放，激活下游的caspase-3，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　冬凌草甲素處理后，膽囊癌細(xì)胞

6、中處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著降低，S期的細(xì)胞比例顯著升高，發(fā)生S期阻滯，cyclin A及cyclinB1表達(dá)明顯下降，而cyclinD1表達(dá)上升。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素組裸鼠成瘤體積及重量比對(duì)照組都明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著下調(diào)膽囊癌細(xì)胞HER2基因的表達(dá);過表達(dá)HER2后，能部分逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素的抗腫瘤效應(yīng)。膽囊癌患者HER2陽性率明顯高于膽囊炎患者(46.7％vs

7、.0％)。膽囊癌患者中HER2的表達(dá)與的病理分期有關(guān)，Ⅲ-Ⅳ期患者HER2陽性率明顯高于0-Ⅱ期患者(59.6％ vs.26.7％)。HER2蛋白表達(dá)與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（Kappa系數(shù)=0.376，P=0.001）。膽囊癌患者HER2表達(dá)陽性與陰性的中位生存時(shí)間分別為18.5個(gè)月和23.5個(gè)月，1年及3年生存率分別為27.7％、16.9％和63.4％、25.1％，HER2陰性患者預(yù)后明顯優(yōu)于HER2陽性患者，且HER2的表達(dá)量及病