氯化鋰誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2-M周期阻滯的機(jī)制探討.pdf

1、鋰鹽(lithium)是一種療效穩(wěn)定的抗抑郁藥。它對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，并能降低惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。雖然鋰鹽對(duì)肌醇一磷酸酶(inositolmonophosphatase，IMPase)，糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)，以及一些磷酸酯酶的抑制作用已比較明確，但它的生物學(xué)作用的機(jī)制并未得到滿(mǎn)意的解釋。本課題以人肝癌細(xì)胞為主要研究對(duì)象，探討了鋰鹽抑制細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　 首

2、先，用MTT法檢測(cè)了氯化鋰對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的作用，結(jié)果顯示它能顯著抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯，進(jìn)一步的Giemsa染色證明細(xì)胞周期停滯于G2期。Western blot結(jié)果顯示氯化鋰能導(dǎo)致cdc2(Tyr15)發(fā)生顯著磷酸化且程度與鋰的劑量正相關(guān)。此外，p53，p21和cyclinB1的蛋白水平也有不同程度的提高。以上結(jié)果提示鋰鹽對(duì)細(xì)胞增殖的抑制與其誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。
　　

3、 接下來(lái)，本研究重點(diǎn)探討了鋰鹽誘導(dǎo)G2期阻滯的機(jī)制。為明確p53是否參與了鋰對(duì)周期的影響，我們用氯化鋰處理表達(dá)野生型p53的HepG2細(xì)胞和p53缺失的Hep3B細(xì)胞，結(jié)果顯示二者都發(fā)生了cdc2(Tyr15)磷酸化和G2/M期阻滯，且在程度上兩種細(xì)胞之間無(wú)顯著差別。鋰鹽能抑制GSK-3和IMPase的活性，對(duì)后者的抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌醇耗竭。但GSK-3特異性抑制劑SB216763不能模擬氯化鋰的作用，肌醇也不能削弱氯化鋰對(duì)周期影響。此

4、外，雖然氯化鋰能使p38 MAPK發(fā)生磷酸化，但p38 MAPK的抑制劑未能消除氯化鋰造成的G2期阻滯。以上結(jié)果提示鋰鹽對(duì)細(xì)胞周期的影響與GSK-3、IMPase和p38 MAPK活性無(wú)關(guān)，p53在其中的作用也不大。
　　 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)點(diǎn)激酶1(Chk1)參與了鋰鹽對(duì)細(xì)胞周期的作用。氯化鋰誘導(dǎo)的G2期阻滯可被Chk1特異性抑制劑SB218078部分逆轉(zhuǎn)，而且Chk1 siRNA，過(guò)表達(dá)kinase dead Chk1均有

5、類(lèi)似效果。氯化鋰能誘導(dǎo)Chk1下游的cdc25C(Ser-216)發(fā)生磷酸化，體外蛋白激酶活性測(cè)定也顯示氯化鋰處理后的細(xì)胞Chk1活性有所提高。但氯化鋰并不能使Chk1(Ser317，Ser345)發(fā)生磷酸化，提示它對(duì)Chk1的作用可能不通過(guò)經(jīng)典的共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ataxia telangiectasiamutated，ATM)/ATM和Rad3相關(guān)蛋白(ATM-and Rad3-related protein，ATR)

6、途徑實(shí)現(xiàn)。這一推斷得到了一些間接的證明：一方面雖然Chk1抑制劑SB218078和ATM/ATR抑制劑咖啡因均可抑制羥基脲引發(fā)的cdc2磷酸化，但氯化鋰的作用卻只能被Chk1抑制劑逆轉(zhuǎn)而不被ATM/ATR抑制劑逆轉(zhuǎn)；另一方面過(guò)表達(dá)磷酸化位點(diǎn)突變的Chk1(S345A/S317A)對(duì)氯化鋰的作用也無(wú)影響。以上這些結(jié)果表明：氯化鋰至少部分通過(guò)Chk1誘導(dǎo)G2期阻滯，而且無(wú)需Chk1磷酸化。氯化鋰誘導(dǎo)G2期阻滯的另一個(gè)途徑是下調(diào)cdc25C磷

7、酸酶。cdc25C負(fù)責(zé)cdc2(Tyr15，Thr14)的脫磷酸化。我們發(fā)現(xiàn)氯化鋰能下調(diào)cdc25C mRNA水平及其蛋白水平，而且cdc25C蛋白水平和cdc2磷酸化在細(xì)胞周期過(guò)程中始終呈負(fù)相關(guān)。
　　 綜上所述，鋰鹽對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制與其誘導(dǎo)G2期阻滯有關(guān)，而周期阻滯的機(jī)制至少有兩個(gè)：Chk1的參與是其中之一，下調(diào)cdc25C蛋白水平也是一種重要原因?？紤]到鋰鹽在降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)方面的作用，因此徹底闡明鋰鹽對(duì)細(xì)胞周期作用的機(jī)制