低氧條件下三氧化二砷通過細胞周期阻滯及誘導凋亡抑制肺癌細胞增殖.pdf

1、肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，也是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤。在世界大多數國家，肺癌的患病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，尤其是發(fā)達國家，肺癌在男性常見的惡性腫瘤中居首位。盡管目前對于肺癌的診斷和治療方法較過去有了很大的提高，但中晚期肺癌患者的生存期仍無明顯延長。對常見化療藥物耐藥是導致晚期肺癌治療失敗的主要原因之一，而腫瘤局部組織低氧與肺癌細胞耐藥性的增加具有顯著的相關性。 局部組織低氧是實體腫瘤微環(huán)境的特征之一，低氧使腫

2、瘤細胞低氧誘導因子1(HIF-1)的含量增加，進而通過誘導一系列低氧適應性基因的表達使腫瘤細胞在低氧環(huán)境中仍具有強大的增殖能力。此外，低氧還可通過誘導多耐藥基因表達、降低細胞內藥物蓄積等機制使腫瘤細胞對化療藥物耐藥，導致許多傳統(tǒng)化療藥在低氧環(huán)境中療效下降。因此，發(fā)掘在低氧條件下對腫瘤細胞仍具有明顯殺傷作用的化療藥物具有重要的治療意義。 三氧化二砷(As2O3)是祖國醫(yī)學的傳統(tǒng)用藥，上世紀被我國學者首次用于治療早幼粒細胞白血病(A

3、PL)并取得較好療效，得到世界公認。體外實驗表明，As2O3對淋巴瘤、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤也有療效，并且As2O3在低氧條件下對白血病、神經母細胞瘤等腫瘤細胞仍有較強的殺傷作用。進一步研究表明，As2O3對多種腫瘤細胞的細胞毒作用主要表現為誘導凋亡，其中阻滯細胞周期進展及調節(jié)細胞周期特異性調控蛋白的表達是其啟動凋亡信號轉導的主要作用機制之一。 基于以上研究現狀，我們提出這樣的問題：As2O3是否能夠在低氧條件下抑制肺癌細胞的增

4、殖?如果能夠，是通過何種機制抑制肺癌細胞增殖的?與這些問題相關的研究國內外目前鮮有報道。本研究則對比觀察了As2O3在低氧(1％O2)及常氧(21％O2)條件下對人肺腺癌A549及A549/R細胞(耐藥細胞株，耐阿霉素、長春新堿等)的增殖及凋亡的影響，比較了As2O3與常規(guī)化療藥長春新堿(VCR)在低氧條件下對肺癌細胞的細胞毒作用的差異，并就As2O3在常氧及低氧條件下對肺癌細胞細胞周期進展及細胞周期特異性調控蛋白表達的影響等問題做了進

5、一步研究。 第一部分常氧及低氧條件下As2O3均通過誘導凋亡抑制肺癌細胞的增殖 本部分實驗以人肺腺癌A549及A549/R細胞為研究模型，觀察不同濃度As2O3在常氧及低氧條件下對A549及A549/R細胞增殖及凋亡的影響，并探討了低氧條件下VCR與As2O3對A549細胞毒性作用的差異。低氧條件由低氧發(fā)生袋獲取。首先分別在低氧及常氧條件下用不同濃度As2O3或VCR作用于A549和(或)A549/R細胞48 h，收集處

6、理后的細胞備用。其次，用MTT法檢測各組細胞經As2O3或VCR處理后的細胞增殖抑制率(％)；對常氧及低氧條件下As2O3處理后的A549細胞進行HIF-1α的Western blot檢測，以明確低氧條件的獲取是否客觀及As2O3對A549細胞HIF-1α蛋白表達的影響。最后，為了明確As2O3及VCR在常氧及低氧條件下對肺癌細胞凋亡的影響，我們用流式細胞儀Annexin V-PI雙染色法檢測不同濃度As2O3或VCR作用于A549和(

7、或)A549/R細胞48 h后細胞的凋亡率(％)。 本部分實驗結果顯示：在A549細胞，當As2O3濃度大于5μmol/L時，細胞增殖抑制率在常氧和低氧條件下均呈劑量依賴性增加，細胞早期凋亡率及總凋亡率在常氧和低氧條件下也均呈劑量依賴性增加，晚期凋亡率及死亡率與對照組相比無明顯改變；在A549/R細胞，當As2O3濃度大于5μmol/L時，細胞增殖抑制率、早期凋亡率及總凋亡率在常氧及低氧條件下均呈劑量依賴性增加，晚期凋亡率及死亡

8、率與對照組相比無明顯改變；在常氧及低氧條件下，As2O3對A549/R的細胞毒作用較A549細胞均無明顯降低。在低氧條件下，As2O3對A549及A549/R.細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用較常氧條件均無明顯降低，而長春新堿在低氧條件下對A549細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用較常氧條件下則明顯減弱。Western blot實驗顯示常氧條件下細胞未表達HIF-1α蛋白，而低氧條件下細胞則大量表達HIF-1α[蛋白，但As2O3對細胞HIF-1

9、α僅蛋白的表達無明顯改變。 本部分實驗表明：第一，As2O3在常氧及低氧條件下對A549細胞及耐藥的A549/R細胞均具有顯著的增殖抑制作用；第二，As2O3主要通過誘導凋亡抑制肺癌細胞的增殖，并且其細胞毒作用在低氧條件下無明顯減弱(與常氧條件相比)，而VCR在低氧條件下對肺癌細胞的殺傷作用則明顯減弱；第三，在本實驗中細胞已充分適應低氧環(huán)境。 第二部分常氧及低氧條件下As2O3通過G2/M期阻滯及下調survivin表達

10、誘導肺癌細胞凋亡 本部分實驗的目的在于探討As2O3誘導人肺腺癌A549細胞凋亡的作用機制。分別在常氧及低氧條件下用不同濃度的As2O3作用于A549細胞48 h，收集各組細胞備用。流式細胞儀檢測細胞周期的分布，半定量RT-PCR法檢測細胞Cyclin B1、CDC2及survivin mRNA的表達，Western blot法檢測細胞Cyclin B1、CDC2、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白

11、的水平。 本部分實驗結果顯示：在常氧及低氧條件下，As2O3均使A549細胞阻滯于G2/M期；As2O3均下調A549細胞Cyclin B1及survivin mRNA的表達，對CDC2mRNA的表達無顯著影響；As2O3均下調549細胞Cyclin B1、phospho-CDC2(Thr-161)及survivin蛋白的水平，對總CDC2蛋白的水平無顯著影響。根據這些結果我們認為，在常氧及低氧條件下As2O3可通過G2/M期阻