三氧化二砷對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期的選擇性作用.pdf

1、[研究背景及目的] 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè)：至2025年,我國(guó)患肺癌人數(shù)將居世界之首,每年新增的肺癌病死例數(shù)將超過(guò)100萬(wàn)。目前治療肺癌的主要方法是多學(xué)科綜合治療,主要包括手術(shù)、化療、放療及生物靶向治療等；這些治療均是通過(guò)不同途徑殺傷腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療目的,但效果不盡如人意,在惡性腫瘤中的肺癌病死率是最高的,5年生存率在我國(guó)僅為10％左右。尋找有效的治療藥物和治療手段是擺在人們面前的一項(xiàng)迫不及待的任務(wù)。 三氧化二砷是

2、中藥砒霜的有效成份,過(guò)去中藥利用其“以毒攻毒”的原則來(lái)治療牙髓病以及銀屑病、梅毒、風(fēng)濕等疾病,因?yàn)橛袆《?臨床應(yīng)用范圍十分狹窄；然而自從20世紀(jì)七十年代三氧化二砷被用來(lái)治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病并且獲得了較高的緩解率以來(lái)；三氧化二砷的抗腫瘤作用同益引起國(guó)人的重視。三氧化二砷不僅對(duì)急性早幼粒細(xì)胞性白血病有效果,對(duì)其它類型的白血病以及其他許多惡性腫瘤,如胃癌、前列腺癌、乳腺癌等都有一定的治療效果。 腫瘤的產(chǎn)生與細(xì)胞分化異常有關(guān)；三氧

3、化二砷可以誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞分化成為成熟粒細(xì)胞,通過(guò)阻滯細(xì)胞周期影響細(xì)胞生長(zhǎng)與分化,達(dá)到抑制腫瘤的作用；誘導(dǎo)分化治療副作用小,療效不比常規(guī)化療差,因此誘導(dǎo)腫瘤分化正成為治療腫瘤的一種新的熱點(diǎn)。如果三氧化二砷對(duì)肺癌細(xì)胞也有一定的誘導(dǎo)分化作用,則有可能轉(zhuǎn)變肺癌的治療模式。目前國(guó)內(nèi)外有相關(guān)研究證實(shí)三氧化二砷對(duì)肺癌細(xì)胞有一定的細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡作用,但研究結(jié)果不盡相同,有報(bào)道三氧化二砷可以使肺癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期也有報(bào)道三氧化二砷可以

4、使肺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期；細(xì)胞周期中G1期稱為細(xì)胞分化期,G1期停滯可作為細(xì)胞分化的指標(biāo),若能使細(xì)胞周期阻滯于G1期,則有可能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞分化。 與其它細(xì)胞毒性藥物不同的是,三氧化二砷在部分低氧的實(shí)體腫瘤組織中作用仍較明顯；而且低氧可以加強(qiáng)三氧化二砷對(duì)白血病的誘導(dǎo)分化作用。低氧及厭氧環(huán)境對(duì)三氧化二砷肺癌細(xì)胞周期阻滯作用將產(chǎn)生怎樣的影響呢?是否更有利于肺癌細(xì)胞分化呢? 依托泊苷(VP-16)是白血病和肺癌治療中常用的藥物

5、,可以使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,低濃度的VP-16能通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑誘導(dǎo)慢性粒急性變的K562細(xì)胞分化。 本實(shí)驗(yàn)首先在常氧環(huán)境下利用三氧化二砷對(duì)肺癌A549細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng),與細(xì)胞周期特異性藥物依托泊苷(VP-16)作對(duì)照,研究三氧化二砷在常氧環(huán)境下對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期的作用特點(diǎn)；然后在微缺氧(5％)、厭氧環(huán)境觀察缺氧對(duì)其細(xì)胞周期阻滯作用的影響；從G1期阻滯角度來(lái)探討三氧化二砷對(duì)肺癌A549細(xì)胞可能

6、存在的誘導(dǎo)分化作用,為臨床上三氧化二砷治療肺癌提供理論依據(jù)。 [實(shí)驗(yàn)方法] 一、實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)處理藥物不同,將消化后的細(xì)胞隨機(jī)分成1μmol/L三氧化二砷與1.0μmol/L VP-16及空白對(duì)照組3個(gè)組,接種于24孔板；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔細(xì)胞接種密度約為3*105個(gè)/孔。 二、細(xì)胞培養(yǎng)：分別在常氧環(huán)境下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)；微缺氧、厭氧環(huán)境下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí),采用厭氧袋發(fā)生法制造微缺氧

7、及厭氧環(huán)境。 三、細(xì)胞收?。涸诟鞣N氧環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)段以后,用含0.25％胰蛋白酶消化液消化各組細(xì)胞,收集、離心、棄上清后PBS洗滌、離心、棄上清兩次,加入70％冰乙醇固定,4℃過(guò)夜。 四、流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量：固定過(guò)夜后的細(xì)胞,加入PBS振蕩洗滌后離心棄上清,加入碘化丙啶(PI)染色,室溫避光孵育后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)；每個(gè)流式細(xì)胞管檢測(cè)細(xì)胞數(shù)不低于8000個(gè),低于G1期DNA含量主峰(亞G1期峰

8、)的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。 五、細(xì)胞周期分析：采用CellQuest軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析,結(jié)果以直方圖進(jìn)行表示；并計(jì)算出各期細(xì)胞比例。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：細(xì)胞周期分析結(jié)果為百分比形式,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,具體分析方法詳見(jiàn)各部分。 [結(jié)果] (一)、常氧環(huán)境As2O3對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的作用1、隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),1μmol/L As2O3組G1期細(xì)胞比例增加,

9、S期細(xì)胞比例減少,作用48小時(shí),G1期細(xì)胞比例為47.04％,S期細(xì)胞比例為50.54％；與空白對(duì)照組相比較,G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05),S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05);與VP-16組比較:G1期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異,S期細(xì)胞比例較高(P<0.05),G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)。 2、1μtmol/L As2O3組各時(shí)段細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段均無(wú)明顯差異,但各時(shí)段均較同等濃度VP-16組明

10、顯減少(P<0.05)。 (二)、不同氧環(huán)境As2O3對(duì)肺癌A549細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的作用1、隨缺氧加重,1μmol/L As2O3組G1期細(xì)胞比例增加,S期細(xì)胞比例減少,與常氧、微缺氧環(huán)境相比,厭氧環(huán)境G1期、G2/M期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05);與空白對(duì)照組比較,微缺氧環(huán)境G1期、S期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異,厭氧環(huán)境G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)、S期細(xì)胞比例明顯減少(P<

11、0.05);與VP-16組相比較：三種氧環(huán)境下各期細(xì)胞比例均有明顯差異,G1期、G2/M期細(xì)胞比例減少(P<0.05),S期細(xì)胞比例增加(P<0.05)。 2、與1μmol/L VP-16組相比較,As2O3組各種氧環(huán)境下細(xì)胞凋亡率均明顯減少(P<0.05);與空白對(duì)照組相比較,常氧及微缺氧環(huán)境無(wú)明顯差異,厭氧環(huán)境反而降低(P<0.05)。 [結(jié)論] 一、低濃度三氧化二砷對(duì)肺癌A549細(xì)胞G1期的阻滯作用具有一定的時(shí)-效