BCG-PPD對γδT細胞殺傷肺癌A549細胞作用的影響.pdf

1、目的：研究卡介菌純蛋白衍生物（PurifiedProteinDerivativeofBCG,BCG-PPD）對人外周血γδT細胞穿孔素和顆粒酶B表達的影響，并進一步探討B(tài)CG-PPD對γδT細胞殺傷肺癌A549細胞的增效作用。
　　方法：
　?。?）制備γδT細胞：采用Ficoll密度梯度離心法分離健康人外周血單個核細胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC），以唑來膦酸(Zoledroni

2、cacid,ZA,終濃度為5nmol/ml)及白細胞介素-2（Interleukin-2,IL-2,終濃度為200IU/ml)刺激擴增γδT細胞；
　　（2）確定最佳效靶比例：培養(yǎng)9-14天后，用流式細胞儀測定PBMC中γδT細胞的比例。按不同的效靶比例（Effector:target,E:T）將γδT細胞與肺癌A549細胞混合培養(yǎng)，48小時后用倒置顯微鏡觀察肺癌A549細胞的生長狀態(tài)，并使用乳酸脫氫酶（Lactatedehydr

3、ogenase,LDH）細胞毒性檢測試劑盒檢測γδT細胞對肺癌A549細胞的細胞毒性，以確定最佳效靶比例。
　?。?）BCG-PPD處理后相關(guān)指標檢測：將γδT細胞與肺癌A549細胞按最佳效靶比例混合培養(yǎng)，并加入不同濃度的BCG-PPD處理，用倒置顯微鏡動態(tài)觀察細胞的生長狀況，48小時后使用LDH細胞毒性檢測試劑盒檢測γδT細胞對肺癌A549細胞的細胞毒性，使用流式細胞儀檢測γδT細胞穿孔素、顆粒酶B的表達，并用透射電鏡觀察肺癌A

4、549細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）體外刺激擴增9-14天后γδT細胞濃度從初始的（4.65±4.36）％增加到（83.82±2.18）%。
　?。?）按不同效靶比例混合培養(yǎng)γδT細胞與肺癌A549細胞時，倒置顯微鏡下可觀察到肺癌A549細胞生長狀況的差異，γδT細胞的細胞毒性作用隨效靶比例的升高而增強，最佳效靶比為20:1。
　?。?）按20:1的效靶比例混合培養(yǎng)，并加入不同濃度的BCG-PPD處

5、理后，流式細胞儀檢測加入濃度為20IU/ml的BCG-PPD處理組γδT細胞對肺癌A549細胞的細胞毒性最強，穿孔素、顆粒酶B的表達均顯著高于未加入BCG-PPD組，倒置顯微鏡動態(tài)觀察到肺癌A549細胞的生長形態(tài)較未加入BCG-PPD組變化更為明顯，透射電鏡觀察到經(jīng)γδT細胞作用后肺癌A549細胞膜完整性被破壞，核膜消失，染色質(zhì)固縮、溶解。
　　結(jié)論：從健康人外周血分離出來的γδT細胞于體外刺激擴增后，對肺癌A549細胞具有殺傷作