川楝子水提物對(duì)肺癌A549細(xì)胞中ERK途徑的影響.pdf

1、目的：探討川楝子水提物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，并初步研究川楝子水提物作用肺癌A549細(xì)胞對(duì)ERK途徑的影響。
　　方法：①本課題研究分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，不同濃度的川楝子水提物（100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml）作用人肺癌A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，未加入藥物(0μg/ml)正常培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞為空白對(duì)照組。采用MTT法檢測(cè)經(jīng)各濃度組川楝子水提物作用48h，對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率

2、；②各組川楝子水提物（100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml）作用A549細(xì)胞(24h、48h、72h）后，采用Western Blot法檢測(cè)磷酸化狀態(tài)的細(xì)胞外調(diào)解激酶1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）、磷酸化狀態(tài)的核糖體S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）相對(duì)分子量為85000～90000（Rsk90）、磷酸化狀態(tài)C-Jun氨基末端激酶1（

3、c-Jun N-terminal kinase，JNK1）蛋白磷酸化水平；③利用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建針對(duì)ERK1因子序列特異性的干擾載體，通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用顯微鏡觀察及RT-PCR法檢測(cè)ERK1的mRNA的表達(dá)初步確定轉(zhuǎn)染情況；④利用G418篩選法培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株；⑤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞經(jīng)各組川楝子水提物（100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml）作用24h，采用Western Blot

4、法檢測(cè)p-ERK1/2、p-Rsk90蛋白磷酸化水平；⑥穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞經(jīng)各濃度川楝子水提物（0μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml）作用48h，采用MTT法檢測(cè)對(duì)A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞增殖抑制率的影響。
　　結(jié)果：①隨著川楝子水提物藥物濃度的加大，對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增高（P＜0.05），但藥物作用濃度從300μg/ml增加至400μg/ml時(shí)，其

5、抑制率變化不明顯（P＞0.05）；②Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：川楝子水提物作用肺癌A549細(xì)胞24h時(shí)，p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平較空白對(duì)照組降低（P＜0.05)，且隨藥物濃度的增加p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平逐漸降低（P＜0.05)。48h、72h時(shí)，p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平較空白對(duì)照組降低（P＜0.05)，且隨藥物濃度的增加p-ERK1/2、p-Rsk90

6、的蛋白磷酸化水平逐漸降低（P＜0.05)，但藥物濃度300μg/ml的p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平較200μg/ml蛋白磷酸化水平無明顯變化（P＞0.05）。而在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)p-JNK1的蛋白磷酸化水平較空白對(duì)照組沒有明顯變化（P＞0.05），不同時(shí)間不同藥物濃度之間的p-JNK1的蛋白磷酸化水平均無明顯變化（P＞0.05）；③由吉?jiǎng)P基因公司合成的MAPK3-RNAi質(zhì)粒，做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，在電子顯微鏡下觀察

7、到綠色熒光蛋白的表達(dá)，證明將質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，并通過RT-PCR方法檢測(cè)ERK1的mRNA的表達(dá)量有明顯降低（P＜0.05)。利用G418篩選法成功得到ERK1因子穩(wěn)定低表達(dá)肺癌A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞系；④Western Blot法檢測(cè)各濃度組川楝子水提物作用轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平極低，轉(zhuǎn)染細(xì)胞各濃度組的p-ERK1/2、p-Rsk90的蛋白磷酸化水平較空白組沒有明顯變化

8、（P＞0.05），隨濃度的增加其蛋白磷酸化水平也無明顯變化（P＞0.05）；⑤不同濃度藥物作用A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞時(shí)MTT結(jié)果顯示：不同藥物濃度組的抑制率與未加入藥物組的抑制率變化不明顯（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1.川楝子水提物可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖。2.川楝子水提物作用肺癌A549細(xì)胞時(shí)可抑制ERK途徑，但對(duì)JNK途徑無明顯影響。3.建立了ERK1因子穩(wěn)定低表達(dá)肺癌A549-MAPK3-RNAi細(xì)胞系。4