卡介苗(BCG)激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷作用研究.pdf

1、目的:初步探討卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)對(duì)高危HPV感染疾病的治療作用，尋求BCG治療抗HPV病毒的證據(jù)。研究在細(xì)胞水平上BCG激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）對(duì)HPV感染細(xì)胞的周期及凋亡的影響，并探討其對(duì)細(xì)胞中HPV-E7蛋白以及RB/E2F1通路的影響。
　　 方法:選擇6個(gè)健康志愿者，抽取新鮮的外周血，用細(xì)胞分離

2、液分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用卡介苗刺激PBMC5天作為BCG激活的殺傷細(xì)胞(BCG-activatedkiller cell,BAK)，未刺激的PBMC作為自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)。激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞與高危HPV18感染轉(zhuǎn)化的宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞在不同濃度比下共同培養(yǎng)。相互作用20小時(shí)后，用MTS法分別檢測(cè)激活的外周血單個(gè)核細(xì)胞和未激活的外周血單個(gè)核細(xì)胞的殺傷率;收集作用后的HeLa細(xì)

3、胞，用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡情況;同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞中E7基因以及RB/E2F1通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平變化。
　　 結(jié)果:在效靶比（效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞，E/T）分別為40∶1、20∶1、10∶1情況下，卡介苗激活的殺傷細(xì)胞（BAK）對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷率分別為24.08％、14.74％、6.8％，而未激活的外周血單個(gè)核細(xì)胞作為自然殺傷細(xì)胞(NK)的殺傷率分別為17

4、.62％、10.78％、5.8％。在效靶比為40∶1和20∶1時(shí)BAK細(xì)胞的殺傷率大于NK細(xì)胞，兩者差別有顯著性意義(P＜0.05)。在20∶1效靶比相互作用下，收集HeLa細(xì)胞做周期及凋亡檢測(cè)顯示BAK組的凋亡率24.2％明顯高于NK組的凋亡率13.45％(P＜0.05)。BAK細(xì)胞或NK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞作用后均可使HeLa細(xì)胞周期抑制在G1期;且兩組HeLa細(xì)胞與空白對(duì)照組正常HeLa細(xì)胞比較RB、E2F1均有顯著性交化，RB表達(dá)

5、升高而E2F1表達(dá)下降。然而兩組的抑制作用以及兩組之間RB、E2F1的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平變化無(wú)明顯差異(P＞0.05)。然而，HPV-E7在轉(zhuǎn)錄水平各組間無(wú)差異(P＞0.05)，在蛋白表達(dá)量上BAK組和NK組比空白對(duì)照組稍有增加，但無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:在細(xì)胞水平上證明了用卡介苗激活的免疫細(xì)胞能夠殺傷高危HPV感染并整合的HeLa細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，而這個(gè)殺傷過(guò)程可能與RB/E2F1這條通路改變密切