結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用.pdf

1、背景及目的：結(jié)核?。═B）是我們?nèi)祟愐阎淖罟爬系膫魅静≈?，結(jié)核分枝桿菌（M.tb）是主要致病因素，所以尋找有效的抗 M.tb藥物或者疫苗一直是各國(guó)研究的重點(diǎn)之一。但是，至今其預(yù)防和治療仍不盡人意。雖然，現(xiàn)有的商業(yè)疫苗已經(jīng)有了卡介苗（BCG），其對(duì)于兒童感染的 TB預(yù)防是有效的，尤其是較嚴(yán)重類型TB（如結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核?。瞧鋵?duì)保護(hù)成人肺結(jié)核方面缺乏穩(wěn)定性。目前對(duì)M.tb的研究主要是運(yùn)用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白

2、作為抗原，誘導(dǎo)不同的免疫細(xì)胞（γδT細(xì)胞、CD3+細(xì)胞等）發(fā)生反應(yīng)，從而深入探究相關(guān)機(jī)制，以便于研制出新的疫苗或者抗TB藥物。M.tb的胞壁中的含有大量的脂類成分，它們就像一層厚厚的保護(hù)莢膜，既可以抵抗不利環(huán)境的侵害，也具有免疫調(diào)節(jié)作用，特別是在宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中均扮演重要的角色，所以這提示M.tb的脂類成分可以成為重要的抗M.tb疫苗或者藥物研究的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先觀察，在體外培養(yǎng)結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞（

3、PBMC）的實(shí)驗(yàn)中，將胎牛血清（FBS）和人AB型血清作為培養(yǎng)液添加劑的效果比較。其次觀察，我們挑選的一些脂類抗原對(duì)人外周血中PBMC活化和增殖的作用，進(jìn)而探討脂類抗原在結(jié)核感染中是否存在特異性免疫作用。
　　方法：（1）抽取健康成人外周血，分別加入結(jié)核桿菌全菌裂解物（WCL）或者同時(shí)給予人重組白細(xì)胞介素-2（rhIL—2）和植物血凝素（PHA），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，之后分別在含10％人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)液和10%F

4、BS的RPMIl640培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后，用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)結(jié)果，運(yùn)用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。（2）運(yùn)用FCM和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）分別檢測(cè)，從PBMC中分里出來(lái)的粘附細(xì)胞被IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)前后的表面抗原（CD11c，CD14，CD83）的表達(dá)，同時(shí)再檢測(cè)已經(jīng)被誘導(dǎo)培養(yǎng)成非成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞（imDCs）且被下列抗原WCL，全脂質(zhì)（TLIP），丙酮可溶性脂質(zhì)（ASLIP），純硫脂（PSLIP

5、），脂阿拉伯糖（LAM），LM，培養(yǎng)液分泌蛋白（CFP），結(jié)核桿菌耐熱抗原（M.tb-HAg），磷酸脂多糖（LPS）和空白對(duì)照組刺激培養(yǎng)后的細(xì)胞表面抗原（CD83）表達(dá)和IL-12分泌情況。（3）運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）分別檢測(cè)，非粘附的PBMC（預(yù)先被CFSE標(biāo)記過(guò)）加入到抗原已經(jīng)刺激過(guò)的imDCs后，共同培養(yǎng)3天后用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)各組培養(yǎng)上清液內(nèi)TNF-α的濃度。當(dāng)培養(yǎng)到第9天，運(yùn)用FCM檢測(cè)各組P

6、BMC的T細(xì)胞亞群（CD3，CD4，CD8，NKT和γδT）增殖和分泌IL-4，TNF-α和IFN-γ的情況。
　　結(jié)果：（1）添加人AB型血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，M.tb WCL對(duì)淋巴細(xì)胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養(yǎng)的增殖效果明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（2）用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)后的粘附細(xì)胞表面CD11c，CD14的比例相較于培養(yǎng)前的比例明顯下降，而表達(dá)CD1a的細(xì)胞比例則明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

7、P<0.05）。（3）所有抗原在刺激imDCs后的成熟度標(biāo)記CD83的比例相較于空白對(duì)照組均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）除了ASLIP組外，其它抗原在刺激imDCs后，其分泌的IL-12的細(xì)胞數(shù)量相較于空白對(duì)照組均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（5）除了ASLIP和LM外，其它各抗原均能導(dǎo)致混合后的PBMC在培養(yǎng)3天后分泌TNF-α的濃度相較于空白對(duì)照組升高，而LM卻能導(dǎo)致PBMC分泌TNF-α的濃

8、度相較于空白對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（6）PBMC培養(yǎng)至9天后，各抗原均能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞增殖，M.tb-HAg能促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）。（7）除了CFP和LM外，其它抗原均能促進(jìn)增殖的CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α，而LM卻能起到抑制作用，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）。此外，除了WCL，TLIP和LM外，其它抗原均能促進(jìn)增殖的γδT細(xì)胞分泌

9、TNF-α，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）。（8）所有抗原均能促進(jìn)增殖的CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，而其中的WCL，ASLIP，M.tb-HAg，LM和LPS還能促進(jìn)增殖的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）。（9）除了TLIP，PSLIP外，其它抗原均能促進(jìn)未增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IL-4，相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）當(dāng)以M