1，25-（OH）-,2-D-,3-對脊柱結(jié)核患者外周血單個核細胞吞噬結(jié)核桿菌的作用研究.pdf

1、目的：通過對脊柱結(jié)核患者外周血單個核細胞在1,25-二羥維生素D3(1,25-(OH)2D3)刺激下在結(jié)核桿菌卡介苗(BCG)作用后的一氧化氮(NO)濃度、一氧化氮合酶(NOS)及各亞型的含量隨1,25-(OH)2D3作用時間及濃度的不同而變化的規(guī)律及各組間的差異性分析，以及對誘導(dǎo)型NOS(iNOS)、神經(jīng)型NOS(nNOS)、上皮型NOS(eNOS)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的mRNA．含量的變化情況進行較全面完整、高靈敏度的定性

2、、定量的隨機對照、雙盲實驗，研究1,25-(OH)2D3對脊柱結(jié)核患者外周血單個核細胞吞噬結(jié)核桿菌的作用，探討它在脊柱結(jié)核患者對結(jié)核桿菌的免疫力的影響和作用機制，為脊柱結(jié)核的臨床治療的新輔助方法的提出提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。 方法： ①根據(jù)實驗要求收集脊柱結(jié)核患者新鮮外周靜脈血標本，采用密度梯度離心法分離單個核細胞，經(jīng)BCG作用后，隨機配對分成實驗組及空白對照組，并分別加入不同濃度的1,25-(OH)2D3及等量DMEM

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在0、3、6、9、12、15天收集其培養(yǎng)上清液，利用一氧化氮試劑盒測定各組NO相對OD值，分析在不同時間點和不同1,25-(OH)2D3濃度刺激下NO的變化及變化規(guī)律；用一氧化氮合酶檢測試劑盒測定不同時間點的各組標本(實驗組1,25-(OH)2D3終濃度為10-8mol/L)的總NOS和iNOS的含量，分析iNOS和cNOS在各組的時間變化規(guī)律。 ②在前述實驗的基礎(chǔ)上，確定1,25-(OH)2D3作用的最佳時間及與

4、濃度的關(guān)系。以同樣方法分離得到單個核細胞、分組培養(yǎng)(實驗組加入10-8mol/L的1,25-(OH)2D3)；培養(yǎng)6天后，離心收集細胞，Trizol試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR擴增，對目的基因iNOS、nNOS、eNOS和TNF-α及參照基因GAPDH的mRNA含量進行分析，以相對定量法即2-△△Ct來比較其差異。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。 結(jié)果： ①脊柱結(jié)核患者外周血單個核細

5、胞在結(jié)核桿菌卡介苗作用后，實驗組和對照組NO相對OD值在細胞培養(yǎng)第3天逐步升高，到第6天達高峰，以后逐漸下降至基線。實驗組與對照組相比，在培養(yǎng)第6天，其NO相對OD值升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義；在培養(yǎng)第3、9、12天，實驗組NO相對OD值也高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。隨著1,25-(OH)2D3濃度的增加，實驗組NO相對OD值逐步增加，并與1,25-(OH)2D3呈劑量依賴關(guān)系。 ②實驗組和對照組iNOS的含量明顯高于結(jié)構(gòu)型

6、NOS(eNOS，包括nNOS、eNOS)，cNOS在標本中含量很低，且與培養(yǎng)時間無明顯關(guān)系；兩組中iNOS含量在培養(yǎng)第3天逐步升高，第6天達高峰，以后逐漸下降，且實驗組iNOS含量與對照組相比，在培養(yǎng)第6天，其iNOS相對OD值升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義；在培養(yǎng)第3天、9天、12天，實驗組NO相對OD值也高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。 ③實驗組iNOS和TNF-α mRNA的2-△△Ct與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義；但nN