應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究小鼠Cyclin B1反義全長(zhǎng)cDNA抑制腫瘤增殖的分子機(jī)制.pdf

1、背景與目的：腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異累積的復(fù)雜過(guò)程，造成腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的原因和機(jī)制非常復(fù)雜，而其中一個(gè)重要原因就是細(xì)胞周期的失控。細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)為有絲分裂期細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1(CDK1)結(jié)合形成促有絲分裂因子(MPF)而調(diào)控細(xì)胞周期。它在許多腫瘤細(xì)胞系均為高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、分化、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等因素有關(guān)，被視為腫瘤具有惡性潛能的標(biāo)志之一。我室先前應(yīng)用全長(zhǎng)反義cDNA

2、技術(shù)靶向小鼠Cyclin B1，發(fā)現(xiàn)其可以降低Cyclin B1基因表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G<,1>期阻滯及凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)，外增殖活性等，但對(duì)其抑瘤機(jī)制尚未進(jìn)行深入探討。而既往其它的一些研究對(duì)此涉及也較少，且多局限于核酸分子或個(gè)別蛋白質(zhì)水平。蛋白質(zhì)組學(xué)可以從整體、動(dòng)態(tài)水平上大規(guī)模、高通量地研究蛋白質(zhì)的分子組成及相互作用規(guī)律等，為探討腫瘤的發(fā)生發(fā)展及致病機(jī)理等提供了一種有力手段。本研究旨在利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)探討小鼠Cyc

3、lin B1反義全長(zhǎng)cDNA抑制腫瘤增殖的分子機(jī)制。 方法：首先用含有小鼠Cyclin B1反義全長(zhǎng)cDNA的重組質(zhì)粒(pAS-mCLB1)及pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株，建立AS-mCLB1及pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(Ac及Pc細(xì)胞)。通過(guò)MTT及細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ac、Pc及未轉(zhuǎn)染組(Nc細(xì)胞)的細(xì)胞增殖活性，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)它們的細(xì)胞周期分布及凋亡。然后用雙向凝膠電泳(2-DE)及基

4、質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分離鑒定Ac組與兩對(duì)照組間的差異蛋白，并對(duì)其中的部分差異蛋白，用RT-PCR及Western blot在mRNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證。最后將三組細(xì)胞分別接種于BALB/c小鼠體內(nèi)，觀察細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤性及荷瘤小鼠的生存時(shí)間，并用HE染色和原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)兩組細(xì)胞的血管生成及細(xì)胞凋亡差異等。 結(jié)果：Ac細(xì)胞與兩對(duì)照(Nc及Pc)細(xì)胞相比，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖受

5、抑、G<,1>期阻滯及細(xì)胞凋亡。利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步鑒定出25個(gè)差異蛋白，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)，15個(gè)表達(dá)下調(diào)。它們分別與細(xì)胞凋亡、癌基因失活、血管生成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)，并對(duì)其中的6個(gè)差異蛋白在mRNA和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接種CT26/Ac細(xì)胞的BALB/C小鼠在接種后第12天成瘤，而兩對(duì)照組分別于第5、6天就已成瘤，而且實(shí)驗(yàn)組小鼠的生存時(shí)間比兩對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。HE染色及凋亡染色顯示在實(shí)驗(yàn)組血管生成減少，

6、凋亡細(xì)胞增加。 結(jié)論：本研究證實(shí)了小鼠Cyclin B1反義全長(zhǎng)cDNA通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)Cyclin B1基因表達(dá)，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G<,1>期阻滯及凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外增殖活性。蛋白質(zhì)組學(xué)方法顯示多種蛋白質(zhì)表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組及兩對(duì)照組間存在明顯差異，這些差異蛋白與細(xì)胞凋亡、癌基因失活、血管生成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)，提示其抑制腫瘤增殖的分子機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，阻滯腫瘤細(xì)胞周期，影響Cycli