質(zhì)膜整合膜蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞膜(質(zhì)膜)蛋白質(zhì)承擔(dān)運(yùn)輸、通訊、防御等功能，是許多藥物的作用靶標(biāo)。細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)組研究正成為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點(diǎn)，這方面的研究可為藥物研發(fā)、疾病診斷提供標(biāo)記蛋白質(zhì)。膜蛋白，特別是整合膜蛋白具有低豐度、難溶、等電點(diǎn)時(shí)易沉淀及難酶解等特點(diǎn)，一直是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的難點(diǎn)。本研究在方法學(xué)上提供了提高質(zhì)膜整合膜蛋白鑒定率的新思路，共分為兩部分： 第一部分：我們將過甲酸氧化技術(shù)(PAOT)與質(zhì)膜膜上順序酶解相結(jié)合。通過甲硫氨酸和半胱氨酸

2、的氧化改變蛋白質(zhì)和肽段的疏水性，從而明顯增加剪切效率以及對(duì)疏水性跨膜區(qū)的檢測(cè)能力。同時(shí)，我們以人類CNE1細(xì)胞系為材料，比較了PAOT與另外一種優(yōu)化好的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶酶解方法，發(fā)現(xiàn)PAOT鑒定到的整合膜蛋白是胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶酶解的2倍，并且這些整合膜蛋白的疏水值大部分都為正值。 第二部分：我們發(fā)展了一種在去垢劑不存在的條件下消化蛋白質(zhì)親水性區(qū)域的方法。首先采用高鹽、高pH以及尿素順序洗脫膜片以去除膜片上的非膜分子

3、，將膜片進(jìn)行熱變性后懸于50 mM NH4HCO3溶液中進(jìn)行胰蛋白酶膜上酶解，得到的不含尿素或其他污染物的肽段通過2DLC-MS/MS進(jìn)行分析。采用這種方法，我們?cè)诖笫蟠竽X皮層質(zhì)膜中鑒定到了327個(gè)蛋白，其中143個(gè)(44％)為整合膜蛋白。我們將此方法與SDC，methanol，urea，Triton X-114，ACN輔助酶解及Tube Gel，SDS-PAGE酶解做了比較，發(fā)現(xiàn)在“shot gun”方法中，采用熱變性結(jié)合NH4HCO