膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中樣品制備與凈化方法的發(fā)展與應(yīng)用.pdf

1、膜蛋白質(zhì)在許多生命活動過程中發(fā)揮著重要的作用,包括細胞與環(huán)境之間的物質(zhì)和能量交換以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。然而,目前對于膜蛋白的研究仍然面臨很大的挑戰(zhàn),這主要是因為膜蛋白大多具有低豐度和強疏水性的特點,從而給這些蛋白質(zhì)的溶解、提取和酶解帶來困難。為了解決這些問題,通常會在膜片的水平上對膜蛋白質(zhì)進行富集,并且通過加入一些高濃度的添加劑(如去垢劑和有機溶劑等)來促進膜蛋白質(zhì)的抽提和溶解。SDS是最有效、最經(jīng)典的去垢劑。但是,由于SDS能夠降低蛋白酶的

2、活力,影響酶解產(chǎn)物的色譜分離和抑制質(zhì)譜分析時的肽段的解離,所以,必須設(shè)法在酶解等后續(xù)實驗步驟之前對樣品進行凈化處理,以除去樣品中的SDS及其他干擾物質(zhì)。傳統(tǒng)的樣品凈化策略主要有沉淀法、透析、離子交換以及凝膠過濾等,盡管這些方法都能在一定程度上除去樣品中的小分子干擾物質(zhì),但它們都有一個共同的缺陷,即在樣品凈化過程中往往導(dǎo)致明顯的蛋白的損失,此外,這些方法還在蛋白質(zhì)鑒定效果和實驗成本等方面存在一定的局限性。在本研究中,我們針對現(xiàn)有方法的缺陷

3、展開研究,發(fā)展了基于凝膠電泳和預(yù)冷丙酮沉淀的樣品制備和凈化方法并將其應(yīng)用于膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 在基于凝膠電泳的方法研究中,我們采用了一種特殊設(shè)計的梯度凝膠電泳(GGE)系統(tǒng),包括一個瓊脂糖上樣層,若干個不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠分級分離層和一個高濃度(40％)的聚丙烯酰胺凝膠封閉層。采用富集的大鼠肝臟膜蛋白作為樣品的實驗結(jié)果表明,通過電泳驅(qū)動的方式,GGE系統(tǒng)能夠去除樣品和凝膠中85％以上的SDS。此外,通過這種電泳驅(qū)動的方

4、式不僅能夠?qū)懈邼舛萐DS的蛋白質(zhì)樣品進行有效的凈化,而且能同時濃縮樣品和對樣品進行分級分離而降低樣品復(fù)雜程度,因而有利于后續(xù)的蛋白質(zhì)酶解和LC-MS/MS分析,大幅度提高蛋白質(zhì)的鑒定效率。與文獻報道的同類樣品凈化方法管膠法和三明治凝膠電泳法相比,GGE策略鑒定的膜蛋白質(zhì)總數(shù)分別提高了213和222,尤其是那些具有極端性質(zhì)(如分子量較高或較低、豐度低或疏水性強)的蛋白質(zhì)的鑒定效果得到明顯的提高。
　　 在基于預(yù)冷丙酮沉淀的樣品

5、制備和凈化策略研究中,我們優(yōu)化了預(yù)冷丙酮沉淀法去除蛋白質(zhì)樣品中SDS及其他小分子干擾物質(zhì)的實驗條件,比較了沉淀蛋白質(zhì)復(fù)溶和溶液酶解的不同策略,建立起一種基于溶液的蛋白質(zhì)樣品制備和凈化的系統(tǒng)方法。該方法綜合利用了SDS對于生物膜的強裂解能力和有效溶解疏水性膜蛋白的能力、丙酮沉淀法高效凈化樣品的能力以及NH4HCO3溶液提供的適合胰蛋白酶有效作用的適宜環(huán)境。實驗結(jié)果表明,利用優(yōu)化的預(yù)冷丙酮沉淀法能使蛋白質(zhì)樣品中的SDS的含量降低至0.01％