Cyclin D1a-b對腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制的研究.pdf

1、Cyclin D1作用于G1期的重要的細胞周期蛋白，可以促進G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細胞周期過程。CyclinD1的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Cyclin D1經(jīng)選擇性剪切后可得到的一種編碼特殊的異構(gòu)體cyclin D1b。細胞增殖與細胞凋亡是相互協(xié)調(diào)，共同維持細胞數(shù)量的相對穩(wěn)定，不至于細胞數(shù)量過度增減。細胞凋亡是一個多分子多基因參與的復雜過程，其中Bcl-2家族成員在凋亡調(diào)控起著重要作用，成員Bcl-2和Bcl-xL等，抑制腫瘤

2、細胞凋亡；成員Bax和Bid等，則促進腫瘤細胞凋亡。Bcl-2與Bcl-xL主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜之間基質(zhì)的pH值，維持跨膜電位的穩(wěn)定，保持線粒體膜的完整性；Bax與在mRNA水平表達的則可降低跨膜電位，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，促進細胞色素C釋放。因此，兩組分子的表達水平的高低及其兩者間的比例決定了腫瘤細胞對凋亡信號的傾向性。腫瘤細胞向鄰近部位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移是影響治療效果及判斷愈后的重要因素。腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成與其誘導產(chǎn)生蛋白酶降解

3、細胞外基質(zhì)和基底膜的能力密切相關(guān)，腫瘤細胞分泌的MMPs中，MMP-2明膠酶和MMP-9明膠酶是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障。腫瘤細胞表達αvβ3與胞外基質(zhì)的相互結(jié)合后，活化的MMP-2與MMP-9的釋放顯著增強，影響腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移等生物行為。Sydencan-1通過分子表面的硫酸肝素側(cè)鏈可結(jié)合細胞粘附分子和基質(zhì)成分等，以共受體方式影響αvβ3的活性調(diào)節(jié)腫瘤細胞與細胞基質(zhì)間的相互作用；α5β1能夠影響的αvβ

4、3功能，sydencan-4能夠協(xié)同α5β1提高這一功效，促進細胞間的黏附。Cdc2是αvβ3整合素的下游效應分子。Cdc2表達上調(diào)后，主要通過與cyclin B2形成共同因子，作用下游caldesmon，影響細胞內(nèi)骨架系統(tǒng)的功能，進而促進腫瘤細胞的遷移。HoxD3是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，HoxD3的過度表達可以上調(diào)整合素αv、α4、aIIb和β3等的表達，影響腫瘤細胞和細胞基質(zhì)間的黏附。Cyclin D1b是否具有和cyclin D

5、1a促進G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細胞周期進程一樣的作用？Cyclin D1b是否影響腫瘤細胞的預后？Cyclin D1a和cyclin D1b是否影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移？本實驗構(gòu)建重組基因質(zhì)粒cyclin D1a/b，并轉(zhuǎn)染至MCF-7人源乳腺癌細胞和BCL-7402人源肝癌細胞中，形成穩(wěn)定表達cyclin D1a/b的新細胞株。研究cyclin D1a/b對腫瘤細胞的增殖和細胞凋亡的作用，并觀察cyclin D1a/b在腫瘤細胞的侵襲能

6、力、穿透能力和黏附能力改變，探討其作用機制。 方法：1．取對數(shù)生長MCF-7細胞的pcDNA3.1亞株、pcDNA3.1-cyclin D1a亞株、pcDNA3.1-cyclin D1b亞株；BCL-7402細胞的pcDNA3.1亞株、pcDNA3.1-cyclin D1a亞株、pcDNA3.1-cyclin D1b亞株，進行MTT檢測。MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞，進行CFSE標記實驗，72 h流式檢測MC

7、F-7細胞和BCL-7402細胞增殖代數(shù)情況。 2．MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞接種于6孔板中，每孔中加入25 μg/ml絲裂霉素。24 h后，AnnexinV/PI標記，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞凋亡情況。取MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞1×106，進行RT-PCR檢測Bcl-2、Bcl-xL、Bax和Bid基因在mRNA水平上表達的變化情況。 3．在裸鼠的右乳墊下接種MCF-7三

8、亞株細胞，接種后第20天、第30天、第45天和第60天測腫瘤瘤體的大小；接種后第30天和第60天處理裸鼠，稱取瘤重。裸鼠肝內(nèi)接種BCL-7402三亞株細胞，接種后第30天和第60天處理裸鼠，稱取瘤重。 4．收集MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞接種于培養(yǎng)皿中，平皿劃痕，24 h后，鏡下觀察腫瘤細胞向劃痕處侵襲生長的情況。MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞分別加入Transwell上室，48 h后，計數(shù)

9、遷移至下室中的細胞數(shù)。MCF-7三亞株細胞和BCL-7402三亞株細胞培養(yǎng)2 h后，LDH檢測黏附至經(jīng)FN包被過的96孔板上的細胞量。 5. 在裸鼠的右乳墊下分別接種MCF-7三亞株細胞和裸鼠肝內(nèi)接種BCL-7402三亞株細胞，接種后第30天和第60天處理裸鼠，取肺臟、肝臟、血液、淋巴、腎臟、胃臟、皮膚和骨髓等組織進行RT-PCR檢測在裸鼠組織中cyclin D1a/b mRNA的表達情況。同時，組織取樣進行HE染色和免疫組化檢

10、測。 6．ECM刺激24 h后的腫瘤細胞和未經(jīng)ECM刺激的腫瘤細胞，進行明膠酶活性的檢測。Real-time PCR檢測腫瘤細胞中αv、β3、syndecan-1和syndecan-4 mRNA的表達情況；采用流式細胞術(shù)檢測αvβ3腫瘤細胞膜表達情況，western blot檢測腫瘤細胞內(nèi)syndecan-1和syndecan-4蛋白表達情況。Real-time PCR檢測ECM刺激24 h和ECM未刺激的腫瘤細胞內(nèi)cdc2 m

11、RNA表達情況和western blot檢測cdc2蛋白表達情況。免疫共沉淀方法檢測腫瘤細胞HoxD3結(jié)合cyclin D1的情況。 結(jié)果：1．MTT檢測結(jié)果表示，在MCF-7細胞和BCL-7402細胞中，cyclin D1a組與pcDNA3.1組和cyclin D1b組比較，能明顯促進細胞增殖。CSFE標記結(jié)果表示，在MCF-7細胞和BCL-7402細胞中，cyclin D1a組與pcDNA3.1組和cyclin D1b組比較

12、，能明顯促進細胞增殖；cyclin D1b能促使特定的一小群細胞以更快的速度增殖。 2. MCF-7細胞，cyclin D1a組、pcDNA3.1組和cyclin D1b組腫瘤細胞的凋亡率分別為：19.92％，17.18％，15.84％；三組間細胞的凋亡沒有明顯的差別。BCL-7402細胞，cyclin D1a組、pcDNA3.1組和cyclin D1b組腫瘤細胞的凋亡率分別則是：34.77％，29.55％，22.52％，cyc

13、lin D1b組與pcDNA3.1組相差12.25％。在絲裂霉素誘導的細胞作用24 h后，BCL-7402細胞中的cyclin D1b組，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達增加；MCF-7細胞中，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達在三組間沒有變化；抗凋亡基因Bcl-xL，促凋亡基因Bax和Bid mRNA的表達在絲裂霉素作用前后，并沒有明顯的改變。在BCL-7402細胞中，抗凋亡基因Bcl-2 參與cyclin D1b促進細胞抵抗絲

14、裂霉素誘導細胞凋亡的機制。 3．在第30天和第60天，右乳墊下接種MCF-7細胞的裸鼠和肝內(nèi)接種BCL-7402細胞裸鼠的瘤重，cyclin D1a組保持較快的增長速度，與pcDNA3.1組、cyclin D1b組比較有顯著性差異，cyclin D1b組瘤重與pcDNA3.1組重，但兩者差異不明顯。 4．腫瘤細胞黏附實驗結(jié)果表示，cyclin D1b組腫瘤細胞的黏附能力強；腫瘤細胞劃痕實驗表示，cyclin D1b組腫瘤

15、細胞的侵襲能力強；Transwell實驗進一步證實了cyclin D1b組腫瘤細胞的穿透能力強的結(jié)果。 5．在裸鼠體內(nèi)接種MCF-7細胞和BCL-7402細胞實驗中，第30天和第60天在cyclin D1b組裸鼠在肺臟和淋巴組織RT-PCR檢測到cyclin D1b的表達，第60天HE染色和免疫組化的結(jié)果進一步證實，cyclin D1b組在裸鼠肺臟組織有微小轉(zhuǎn)移灶的形成。第90天，cyclin D1b組在裸鼠肺臟組織有肉眼可見轉(zhuǎn)

16、移灶的形成。 6．明膠酶活性的檢測結(jié)果表示，ECM 未刺激后24 h MCF-7 三亞株細胞和BCL-7402 三亞株細胞proMMP-2/9和active MMP-2/9 酶活性沒有明顯的差異。 結(jié)論：在體內(nèi)體外實驗中，cyclin D1a作用于G1期重要的細胞周期蛋白，促進G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細胞周期過程，促進腫瘤細胞的增殖和生長；cyclin D1b參與促進腫瘤細胞的增殖生長，能促進腫瘤細胞抵抗凋亡產(chǎn)生。HoxD3