TLRs配體對細(xì)胞增殖分化的影響及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、大多數(shù)的多細(xì)胞生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套有效的識別和清除感染病原體的免疫反應(yīng)系統(tǒng)，即天然免疫(innateimmunity)和獲得性免疫(adaptiveimmunity)。病原體在漫長的進(jìn)化過程中一直保留著一部分結(jié)構(gòu)成分，這種保守分子結(jié)構(gòu)被稱作病原體相關(guān)分子模式(pathogen—associatedmolecularpatterns，PAMPs)。天然免疫在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一套天然免疫識別分子，又稱模式識別受體(pattern

2、recognitionreceptors，PRRs)來辨別PAMPs并發(fā)現(xiàn)病原體的存在。ToⅡ樣受體(Tolllikereceptor，TLRs)是進(jìn)化中形成的PRRs，從無脊椎動物一直保留到人類，人體Toll樣受體家族目前已被確認(rèn)的成員共有11個，機(jī)體感染期間，不同的PAMPs成為“危險信號”，由特定的TLR識別后將啟動不同胞內(nèi)級聯(lián)通路的活化，最終導(dǎo)致NF-кB的轉(zhuǎn)位與相應(yīng)免疫基因的活化而轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致多種效應(yīng)分子的基因表達(dá)，如炎性細(xì)胞因

3、子、趨化因子、共刺激分子、主要組織相容性復(fù)合物及多重效應(yīng)分子等，從而成為生物抵御外物入侵的第一道防線。提示TLRs在誘發(fā)宿主先天性免疫防御反應(yīng)和各種炎癥過程中起著重要的作用，并成為聯(lián)系后天性免疫系統(tǒng)的紐帶。 人工合成含CpG的寡核苷酸(OligonucleotidescontainingCpGmotifs，CpG-ODN)為TLR9配體，可與TLR-9結(jié)合而最終激活NFкB，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的分泌，提高細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)，刺激

4、B細(xì)胞分泌抗體，為激發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng)的重要分子。并且CpGODN刺激分泌的細(xì)胞因子以IL-12為主，可隨后誘導(dǎo)Th1型的免疫反應(yīng)。由於含CpGmotif的ODN可激活多種免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型的免疫反應(yīng)，已廣泛用于抗病毒，抗細(xì)菌感染，抗腫瘤，治療過敏性疾病研究和作為免疫佐劑用于免疫治療。 免疫系統(tǒng)作為機(jī)體防衛(wèi)危險因素、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)體系，其內(nèi)部存在著錯綜復(fù)雜的相互作用對于廣泛表達(dá)在天然免疫細(xì)胞和特異性免疫細(xì)胞表面的T

5、LRs，深入研究其配體識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫因子活化等各個環(huán)節(jié)為進(jìn)一步認(rèn)識免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能提供了新視角，并為研究疾病發(fā)生機(jī)制、宿主對疾病的易感性等問題提供了新的啟迪。隨著免疫學(xué)以及生命學(xué)科整體的飛速發(fā)展，注重進(jìn)化淵源特點(diǎn)和環(huán)境與宿主相互作用關(guān)系與結(jié)果給免疫學(xué)研究帶來新的生機(jī)，同時也是天然免疫在沉寂多年后重新成為研究熱點(diǎn)的客觀背景。本實(shí)驗(yàn)研究了TLRs配體對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響效應(yīng)及TLR9配體的抗腫瘤活性。 第一部分TLR

6、s配體對大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 目的：炎癥與再生修復(fù)在生物進(jìn)化中是彼此相連的過程。干細(xì)胞(Stemcells/progenitorcells)的存在能促使損傷組織的修復(fù)與再生，長期以來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem，CNS)的損傷與再生一直是困擾人類健康的難題.無法找到良好的治療方法，研究證明成體哺乳動物CNS內(nèi)存在類似干細(xì)胞性質(zhì)的神經(jīng)前體細(xì)胞(neuralprogenitorcellsNPCs)

7、，NPC是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)長期提供新細(xì)胞(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)的源泉，將成為CNS疾病治療的新手段，因此NPCs的發(fā)現(xiàn)給因疾病或外傷所致的CNS功能喪失的治療修復(fù)帶來了希望。脊髓內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞(neuralprogenitorcells，NPCs)可促使脊髓損傷組織的修復(fù)，然而，調(diào)節(jié)NPCs增殖與分化的機(jī)理迄今未明，我們在此研究篩選出了某些Toll樣受體(Tolllikereceptor，TLR)配體經(jīng)腹腔注射給藥后可引起脊髓NPCs增殖。

8、方法：大鼠經(jīng)單次腹腔注射TLR不同配體，增殖的細(xì)胞由BrdU跟蹤標(biāo)記。增殖的NPCs由抗巢蛋白nestin與抗BrdU的雙染抗體標(biāo)記，增殖的Microglia由抗ED-1與抗BrdU雙染抗體標(biāo)記.結(jié)果：PSCpG-ODN未引起脊髓NPCs的明顯增殖，而PolyI：C、LPS、與R848可引起B(yǎng)rdU+細(xì)胞顯著性增加。注射PolyI：C或R848的大鼠脊髓BrdU+細(xì)胞密度于注射后2-3天達(dá)最高，隨后快速降至正常水平?？梢夿rdU+/ne

9、stin+雙陽性細(xì)胞的存在，提示有增殖的NPCs的存在，很少見ED-1+/BrdU+雙陽性細(xì)胞，提示增殖的非Microglia細(xì)胞.此外，伴隨NPCs增殖的還有CNS先天免疫系統(tǒng)的激活，如神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。然而，細(xì)胞的增殖及microglia的活性被皮質(zhì)類固醇藥物地塞米松幾乎完全抑制，卻未受消炎痛的影響。結(jié)論：某些TLR的配體被TLR識別后可能參與脊髓內(nèi)正常神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生過程，提示先天性的免疫系統(tǒng)與再生修復(fù)過程之間的相互作用的復(fù)雜性

10、，PAMPs被TLR受體所識別顯示出與炎癥性及再生修復(fù)過程的緊密相關(guān)，這對開發(fā)促進(jìn)組織再生修復(fù)的藥劑，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選平臺來說是一有價值的工具。 第二部分TLR9配體CpG-ODN殼聚糖納米粒的制備及其提高抗腫瘤活性研究 目的：腫瘤的基因治療可通過導(dǎo)入外源寡核苷酸(oligonucleotides，ODN)，改變腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)，直接殺傷或減緩腫瘤細(xì)胞的生長，抑止腫瘤血管形成，激活機(jī)體對腫瘤抗原的免疫應(yīng)

11、答或阻止腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散等方式達(dá)到腫瘤治療的目的。腫瘤的基因和免疫治療一般要求治療性O(shè)DN能夠進(jìn)入細(xì)胞，到達(dá)作用靶部位，并在機(jī)體內(nèi)保持足夠的穩(wěn)定性。CpG-ODN可與TLR-9結(jié)合最終激活多種免疫細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Th1型的免疫反應(yīng)，己廣泛用于抗病毒，抗細(xì)菌感染，抗腫瘤等疾病研究。殼聚糖作為基因載體的多功能性，有廣泛的應(yīng)用前景，但是國內(nèi)外目前的研究主要在體外轉(zhuǎn)染階段，對其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的研究非常有限。本研究選用殼聚糖作包裹CpG-O

12、DN的包囊材料，制備了殼聚糖-CpG-ODN納米復(fù)合物，并將其注射轉(zhuǎn)染于動物體內(nèi)驗(yàn)證了其抗腫瘤的生物效應(yīng)。方法：殼聚糖作包裹CpG-ODN的包囊材料，制備了殼聚糖-CpG-ODN納米復(fù)合物，將其皮下注射于罹患腫瘤的小白鼠，應(yīng)用MTT法檢測了各組CTL殺傷殺傷率，采用ELISA法分析了各組抗瘤細(xì)胞因子的分泌情況，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測了各組腫瘤細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果：殼聚糖-CpGODN納米粒組的各項(xiàng)抗瘤指標(biāo)均優(yōu)于其它組。結(jié)論：顯示殼聚糖具有增

13、強(qiáng)CpGODN抗腫瘤的效應(yīng)，TLR9及其配體CpGODN在腫瘤免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫中發(fā)揮了一定作用，為CpGODN用于腫瘤的基因和免疫治療打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 總之，越來越多的研究表明非特異性免疫在腫瘤免疫中具有重要作用，TLRs的為我們探索先天免疫與獲得性免疫揭開了美好的前景，為各種疾病提供了新的治療思路，增強(qiáng)TLRs信號通路的試劑可能是抵抗病原生物或腫瘤的較好佐劑，用CpGDNA激活TLR9信號通路可能是多種疾病，尤其對腫瘤來