Thiocoraline的抗腫瘤活性及其耐藥機制研究.pdf

1、不良的藥代動力學特征，藥物的毒副作用，特別是藥物耐藥性的出現(xiàn)，使化療藥物在臨床腫瘤治療中的效果大幅降低。而海洋復雜多變的生存環(huán)境，賦予了生活在其中的生物特殊的抵御手段，這些化學或者生物適應產(chǎn)生了許多具有特殊生物活性和潛在抗腫瘤效應的化合物。Thiocoraline即噻可拉林，為含硫縮肽，是一種DNA雙嵌插劑，最初是從海洋單胞菌Micromonospora marina中分離得到，在抗癌活性方面有很好的效果。
　　本課題以thioc

2、oraline為研究對象，研究thiocoraline抗腫瘤活性及乳腺癌對thiocoraline產(chǎn)生耐藥的分子機制。使用MTT法檢測thiocoraline對MCF-7細胞，L-02細胞的毒性作用;利用MTT法和結(jié)晶紫染色比較thiocoraline和doxorubicin對MCF-7細胞的作用效果;流式細胞術檢測thiocoraline對細胞周期的影響;Hoechst33342和Western Blot檢測thiocoraline誘

3、導細胞凋亡情況;通過濃度梯度遞增法培養(yǎng)得到對thiocoraline耐藥的MCF-7/T細胞株，并確定其耐藥指數(shù)。利用生長曲線和克隆形成實驗比較MFC-7細胞與MCF-7/T耐藥細胞的生物學特征。通過半定量PCR初步篩選出與thiocoraline相關的耐藥靶點;qPCR，Western Blot進一步分析比較耐藥細胞MCF-7/T與MCF-7細胞之間的差異。針對Akt位點，用慢病毒構(gòu)建的MCF-7/Akt1細胞株和Akt磷酸化抑制劑M

4、K-2206HCl，通過MTT法及Western Blot實驗深入研究thiocoraline引起MCF-7耐藥的分子機制。利用MK-2206HCl抑制MCF-7/T耐藥細胞中Akt蛋白的磷酸化，通過MTT法檢測其逆轉(zhuǎn)MCF-7/T耐藥細胞對thiocoraline耐藥性的作用效果。
　　MTT法和結(jié)晶紫實驗結(jié)果表明thiocoraline對MCF-7細胞具有顯著的殺傷活性，在納摩爾級的濃度下即可發(fā)揮抗腫瘤效應。肝正常細胞L-02

5、對thiocoraline不敏感，當thiocoraline濃度為100nmol/L時，L-02細胞的成活率為69.43±13.48％。Thiocoraline對MCF-7細胞48h的IC50值為53.8±2.53nmol/L，與doxorubicin相比，對腫瘤細胞有更高的細胞毒性。流式細胞儀分析MCF-7細胞周期結(jié)果表明，thiocoraline可將MCF-7細胞的細胞周期阻滯在S期，從而抑制腫瘤細胞的增殖。Hoecst33342染

6、色和Western Blot實驗結(jié)果顯示，thiocoraline可通過激活Caspase通路而誘導細胞發(fā)生凋亡。在前期系列天然產(chǎn)物抗腫瘤活性研究基礎上，針對乳腺癌細胞耐藥性這個突出問題，以乳腺癌耐藥細胞MCF-7/T為研究模型，篩選與thiocoraline耐藥相關的蛋白，深入探究影響腫瘤細胞對藥物敏感性的因素。通過細胞生長曲線和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞在體外的增殖速率高于MCF-7/T細胞。qPCR和Western Blot實

7、驗顯示，thiocoraline作用MCF-7細胞后，引起Akt蛋白磷酸化，長期作用下使下游乳腺癌耐藥蛋白(Breast Cancer Resistant Protein，BCRP)的表達水平升高，通過PI3K/Akt/BCRP通路誘導細胞產(chǎn)生耐藥性。MTT實驗結(jié)果表明，MCF-7細胞對thiocoraline的敏感性，隨著細胞內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平的提高而降低。使用Akt磷酸化抑制劑MK-2206HCl可顯著提高MCF-7細胞對thi

8、ocoraline的敏感性，并且可部分逆轉(zhuǎn)MCF-7/T耐藥細胞對thiocoraline的耐藥。
　　總之，thiocoratine長期處理可使MCF-7細胞通過PI3K/Akt/BCRP通路產(chǎn)生耐藥性，而MK-2206HCl通過抑制Akt蛋白磷酸化，顯著提高MCF-7細胞對thiocoraline的敏感性，上述實驗結(jié)果表明抗腫瘤活性化合物thicoraline聯(lián)合Akt磷酸化抑制劑MK-2206HCl，或許可以避免化療藥物耐藥