壁虎多肽的制備及其抗腫瘤機制研究.pdf

1、目的：本研究是從壁虎醇提物（Gecko ethanol extract，GEE）中提取出壁虎多肽混合物（Gecko peptides mixture, GPM），并在體外對壁虎多肽混合物抑制腫瘤細(xì)胞生長及其機制進(jìn)行初步探究。
　　方法：將壁虎醇提物用蒸餾水配置成濃度為50mg/mL的溶液，經(jīng)G-25葡聚糖凝膠柱層析后回收各峰溶液，冷凍干燥后對其進(jìn)行活性篩選，具有抗腫瘤活性的成分即為壁虎多肽混合物；用Bradford法檢測壁虎多肽混

2、合物的蛋白含量。體外培養(yǎng)食管癌 EC109和肝癌 HepG2細(xì)胞，采用 MTT法檢測壁虎多肽混合物對 EC109和 HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用；倒置顯微鏡下觀察壁虎多肽混合物(0-0.3mg/mL)作用EC109和HepG2細(xì)胞24 h后形態(tài)的變化；Hoechst33258熒光染色法觀察壁虎多肽混合物作用24 h后EC109和HepG2細(xì)胞的凋亡變化；免疫組化法觀察壁虎多肽混合物作用EC109細(xì)胞24 h后caspase-3及Bcl-

3、2的蛋白表達(dá)情況；caspase活性測試檢測壁虎多肽混合物作用 HepG2細(xì)胞24 h后caspase-3與caspase-9蛋白活性的變化；Western blot檢測壁虎多肽混合物作用于HepG2細(xì)胞24 h后caspase-3，caspase-9，AIF與Cyt c蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：經(jīng)G-25葡聚糖凝膠柱層析后，可將壁虎醇提物分為4個峰，活性檢測后發(fā)現(xiàn)峰A具有顯著的抗腫瘤活性，即為壁虎多肽混合物；Bradford法

4、檢測壁虎多肽混合物的蛋白含量為43.9％。壁虎多肽混合物在體外對 EC109和 HepG2細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，隨著時間的增加與劑量的增大，抑制作用更明顯。0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL壁虎多肽混合物處理這兩種腫瘤細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，EC109細(xì)胞半數(shù)抑瘤率IC50分別為0.317mg/mL、0.227mg/mL、0.183mg/mL，HepG2細(xì)胞

5、半數(shù)抑瘤率 IC50分別0.154 mg/mL、0.133 mg/mL、0.051mg/mL。壁虎多肽混合物作用這兩種細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察可見，與陰性對照組相比，給藥組細(xì)胞數(shù)目減少，變圓、皺縮，體積減小，且隨著劑量的增加，脫壁的細(xì)胞增多。壁虎多肽混合物作用 EC109，HepG2細(xì)胞24h后，Hoechst33258熒光染色結(jié)果顯示給藥組出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、致密、熒光增強等明顯的凋亡形態(tài)，且與低劑量組相比，高劑量組細(xì)胞凋亡更加明顯

6、。壁虎多肽混合物作用EC109細(xì)胞24 h后，免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)藥物處理后，凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低、caspase-3表達(dá)增高，與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.01）。壁虎多肽混合物作用HepG2細(xì)胞24h后，凋亡蛋白caspase-3，caspase-9活性增強，呈現(xiàn)濃度依賴性；AIF和Cyt c從線粒體中釋放到胞漿中，蛋白表達(dá)增加，caspase-3，caspase-9蛋白表達(dá)升高。
　　結(jié)論：壁虎多肽混