家蠅蛹中抗腫瘤多肽的分離純化及其作用機(jī)理研究.pdf

1、家蠅是一種重要的昆蟲(chóng)研究資源。從幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)家蠅都生長(zhǎng)在雜菌橫生的環(huán)境中，在人和動(dòng)物之間傳播病菌，而自身卻很少被感染。家蠅體內(nèi)存在一系列的生物活性物質(zhì)。從家蠅蛹或幼蟲(chóng)中分離純化得到的凝集素已被證實(shí)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，然而，關(guān)于家蠅蛹多肽及其抗腫瘤活性方面的研究報(bào)道卻很少。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)凝膠過(guò)濾層析和離子交換層析從家蠅蛹中分離純化得到一種抗腫瘤多肽(MATP)。Tricine-SDS-PAGE和反相高效液相色譜結(jié)果證明MATP是分

2、子量約為18kDa的單一組分。體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MATP對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2具有明顯抑制作用，且對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02無(wú)明顯抑制作用。HE染色、AO/EB雙染和Hoechst33342/PI雙染觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)MATP誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明HepG2細(xì)胞被MATP阻滯在S期且凋亡率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。
　　熒光染色和免疫印記結(jié)果表明MATP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS從而使

3、MAPK家族中JNK蛋白的磷酸化表達(dá)上調(diào)，而對(duì)ERK和p38蛋白的磷酸化則沒(méi)有明顯影響;同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS抑制劑(NAC)與JNK抑制劑(SP600125)預(yù)處理后，MATP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡率降低，證明ROS/JNK參與了MATP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另外，免疫印記結(jié)果表明MATP下調(diào)Akt蛋白的磷酸化表達(dá)，從而阻止IκBα降解，但這一變化可能并不依賴于ROS;同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑(LY294002

4、)預(yù)處理后，MATP作用的HepG2細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，證明Akt也參與了MATP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。免疫熒光染色和免疫印記結(jié)果表明MATP通過(guò)JNK蛋白的磷酸化上調(diào)和Akt蛋白的磷酸化下調(diào)阻止NF-κBp65入核;同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑(PDTC)預(yù)處理后，MATP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，證明MATP通過(guò)JNK和Akt共同阻止NF-κBp65入核誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外MATP通過(guò)阻止NF-κBp65入核下