自組裝抗腫瘤多肽的設計合成、表征和作用機制研究.pdf

1、癌癥是人類健康的一大殺手，具有難以治愈、致死率高等特點。對于癌癥的治療，目前應用最廣泛的小分子化療藥物往往具有溶解性不佳、細胞選擇性差、毒副作用明顯等缺點，且容易使細胞產(chǎn)生多重耐藥性，進一步提高了腫瘤治療的難度。因此，人們亟待研發(fā)出一類能夠有效解決或避免上述問題的新型抗腫瘤藥物。
　　抗腫瘤多肽是一類可以抑制腫瘤細胞生長或者殺死腫瘤細胞的多肽，主要來源于抗菌肽。大多數(shù)抗腫瘤多肽都屬于裂解肽，其作用位點在細胞膜上，它們不需進入細胞內(nèi)

2、部即可裂解細胞膜殺死細胞，從而能夠有效克服細胞的多重耐藥性;同時，它的化學本質(zhì)是多肽，具有生物活性高、生物相容性好、合成方法成熟等優(yōu)點，因此，抗腫瘤多肽為腫瘤治療提供了新的方案。然而，抗腫瘤多肽也有許多缺點，如藥效有待提高、作用機制不明確、穩(wěn)定性差等，需要我們對其進行針對性地優(yōu)化，以提升其應用潛力。
　　分子自組裝行為廣泛存在于自然環(huán)境和生命體系中，具有自組裝能力的分子種類繁多，多肽是其中一個重要的組成部分。多肽的自組裝過程受多種

3、非共價作用力的影響，且對環(huán)境條件的改變具有響應性，因此它們被視為一類“智能型”生物材料，在細胞培養(yǎng)、藥物載體、組織工程等方向均顯示出巨大的應用潛力。自組裝行為對抗腫瘤多肽性質(zhì)和功能的改變也具有重要作用，它可以通過改變多肽的結構和電荷分布而對抗腫瘤多肽的環(huán)境響應性、細胞選擇性、穩(wěn)定性等方面產(chǎn)生影響，因而被視為抗腫瘤多肽的有效優(yōu)化手段。
　　為了解決抗腫瘤多肽的應用問題，我們嘗試從兩方面對其進行改進。一方面，我們對抗腫瘤多肽的細胞活性

4、進行優(yōu)化，并深入了解其作用機制，在提高其抗腫瘤活性的同時，對其結構與功能之間的關系進行分析總結，為高效抗腫瘤多肽的設計和發(fā)展提供有益的指導;另一方面，我們通過引入多肽自組裝，針對性地解決抗腫瘤多肽的穩(wěn)定性問題，同時進一步了解多肽的結構、活性和穩(wěn)定性三者之間的關系，以期為無載體抗腫瘤多肽藥物的設計和優(yōu)化提供有效方案。最后，我們利用多肽的自組裝性質(zhì)嘗試構建一種環(huán)境響應性多肽水凝膠材料，拓展自組裝多肽的應用方向。
　　在本論文中，我們采

5、取生物化學、細胞生物學等方面的實驗手段，對抗腫瘤多肽序列進行優(yōu)化并深入了解了其細胞作用機制，并將自組裝的思路引入了抗腫瘤多肽的優(yōu)化設計和環(huán)境響應性生物材料的構建當中，主要取得了以下進展:
　　1.新型抗腫瘤多肽的序列設計、優(yōu)化及作用機制研究。以多肽Maurioporin為模板設計并合成了一條抗腫瘤多肽ZXR-1(FKIGGFIKKLWRSKLA)，通過將賴氨酸有目的地突變?yōu)楸彼?，得到了親疏水面界限更加分明的多肽ZXR-2（FKI

6、GGFIKKLWRSKLA），MTT結果顯示突變后多肽整體抗腫瘤活性明顯增強;通過激光共聚焦觀察、Western Blot、流式細胞儀分析等手段對多肽的細胞作用機制進行表征，發(fā)現(xiàn)兩條序列上高度相似的多肽在突變前后，細胞作用機制發(fā)生明顯變化: ZXR-1能夠進入細胞，破壞線粒體電位，最終誘導細胞凋亡，而ZXR-2則直接作用于細胞膜，裂解細胞。我們分析，二者的作用機制差異一方面來源于兩親性和電荷分布的區(qū)別，另一方面，多肽序列中“異亮氨酸-亮

7、氨酸”對（I3-L10，I7-L14）也對多肽的抗腫瘤活性和作用機制產(chǎn)生了一定影響。這一氨基酸對的發(fā)現(xiàn)以及它對抗腫瘤多肽在活性和作用機制上的影響在前人的研究中鮮有報道，對ZXR-1和ZXR-2的結構功能關系的分析能夠為后續(xù)新型抗腫瘤多肽和多肽相關藥物的設計及優(yōu)化提供有益指導。
　　2.抗腫瘤多肽的自組裝改造與結構功能研究。將多肽自組裝機制應用于抗腫瘤多肽的改造上，通過在無自組裝能力的抗腫瘤裂解肽PTP-7(FLGALFKALSKL

8、L)的氮端和碳端分別加入谷氨酸和天冬酰胺，成功構建了兩條序列高度相似的自組裝抗腫瘤多肽EN(ENFLGALFKALSKLL)和NE(FLGALFKALSKLLNE)。這一方法在改變多肽兩親模式和二級結構的同時，有效調(diào)控了多肽的自組裝過程。電鏡結果顯示，不同的兩親結構模式使二者形成了不同納米結構，EN傾向于形成納米纖維而NE傾向于形成膠束。盡管二者都顯示出了長效的抗腫瘤活性和穩(wěn)定性，但微觀形態(tài)對其抗腫瘤活性具有重要影響，它能夠直接控制單分

9、子聚集以及單分子從聚集體上解離的難易程度，進而能夠調(diào)控抗腫瘤多肽的生物活性。不同兩親模式的構建可以有效控制抗腫瘤多肽藥物的細胞活性和穩(wěn)定性，這一機制的引入可被應用于多種多肽藥物的設計中，提高無載體多肽藥物的穩(wěn)定性和活性，為后續(xù)抗腫瘤多肽藥物的設計和臨床應用提供參考。
　　3.利用多肽自組裝性質(zhì)構建環(huán)境響應性水凝膠材料，拓展多肽自組裝的應用方向。以RTX序列(GGXGXDXUX)為模板設計合成了一條具有pH和鈣離子雙重響應性的多肽兩