C2ORF40及其小分子多肽抗腫瘤作用及機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是臨床上一種常見的惡性腫瘤，且無論是在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家都高居女性因腫瘤死亡原因的前列。在我國，自從上世紀(jì)九十年代以來，國民經(jīng)濟(jì)水平有了重大發(fā)展，老百姓的生活水平普遍有了較大提高，人民的生活方式也隨之產(chǎn)生了顯著改變，而同時(shí)乳腺癌在我國很多地區(qū)的發(fā)病率卻不斷提高。當(dāng)前醫(yī)療技術(shù)和水平與以往相比有了巨大提高，但臨床上針對乳腺癌的有效治療手段依然有限:外科手術(shù)切除依然是臨床上治療乳腺癌的一項(xiàng)最主要的治療方案，但患者術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率

2、很高;目前對乳腺癌的輔助治療方案主要包括放射治療和化學(xué)藥物治療等療法，但這些治療方案普遍對患者有不同強(qiáng)度的副作用，甚至對正常機(jī)體功能有嚴(yán)重影響。因此，如何能深入探究乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子作用機(jī)制，研發(fā)新的早期診斷標(biāo)記和開發(fā)相應(yīng)的有效治療方案對臨床上乳腺癌的治療具有及其重要的價(jià)值。
　　C2ORF40(chromosome2 open reading frame40)，別名esophageal cancerrelated gen

3、e4或proaugurin，是一種高度保守的基因，其最早的研究報(bào)道見于1998年科學(xué)家對食管癌的研究，目前對其相關(guān)研究和認(rèn)識還很局限。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，C2ORF40可能是一種候選抑癌基因，不斷有研究結(jié)果證實(shí)其在諸多細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中能夠發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。近來研究結(jié)果表明C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平在許多腫瘤疾病中發(fā)生了明顯下調(diào)，包括食管癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，并且臨床研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)

4、與腫瘤病人預(yù)后有十分密切的關(guān)聯(lián)。C2ORF40被視為一種重要的抑癌基因，但目前對其在腫瘤中的蛋白表達(dá)水平及臨床意義少有研究報(bào)道。同時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是惡性腫瘤的一項(xiàng)重要基本特征，能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞增殖活力大大增強(qiáng)，且腫瘤惡性程度不斷加重。因而，對細(xì)胞周期及其相關(guān)調(diào)控基因的深入研究有助于闡明腫瘤如何發(fā)生與其發(fā)展的分子機(jī)制，并有助于發(fā)現(xiàn)針對腫瘤進(jìn)行早期有效篩查和診斷的相關(guān)的分子標(biāo)記物，為治療臨床上腫瘤疾病提供堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。目前，C2ORF

5、40被廣大學(xué)術(shù)界視為一種潛在的抑癌基因及重要的治療靶點(diǎn)，但是其在乳腺腫瘤中的具體作用及分子機(jī)制還未明確。本課題經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者臨床病例組織中C2ORF40蛋白表達(dá)水平發(fā)生了顯著降低，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)C2ORF40表達(dá)水平和腫瘤中很多重要的臨床病理學(xué)特征有十分緊密的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)C2ORF40基因能夠編碼148個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，并且這種蛋白包含能夠被弗林蛋白酶或凝血酶所特異性識別位點(diǎn)，能夠經(jīng)被相應(yīng)的蛋白酶剪切處理從而生成

6、多種小分子多肽。已有研究證實(shí)在某些細(xì)胞條件培養(yǎng)基中能夠檢測到這些分泌的小分子多肽，并且獲得的這種條件培養(yǎng)基上清液具有抑制細(xì)胞增殖的能力。但目前還沒有關(guān)于來源于C2ORF40基因的小分子多肽能否作用于乳腺癌的研究報(bào)道。本論文發(fā)現(xiàn)一種C2ORF40衍生物，其作為小分子多肽來源于C2ORF40基因并經(jīng)凝血酶剪切處理生成，有著明顯的抗腫瘤活性，我們通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，這種源于C2ORF40的衍生物能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲和轉(zhuǎn)移能

7、力。更重要的是，我們對于C2ORF40如何發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行了深入探宄，研究結(jié)果證明C2ORF40能夠通過調(diào)控重要的有絲分裂基因，顯著影響細(xì)胞周期進(jìn)程，在有絲分裂進(jìn)程產(chǎn)生障礙，以阻礙乳腺癌細(xì)胞的生長，從而發(fā)揮其抗腫瘤功能。
　　本研究課題主要探索了C2ORF40及其衍生物對乳腺癌的抗腫瘤作用，并對可能的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。該項(xiàng)研究不僅進(jìn)一步闡明了C2ORF40的生物學(xué)功能，并對其分子作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，同時(shí)為開發(fā)

8、臨床上針對乳腺癌新的診斷指標(biāo)和研發(fā)新的有效治療方案提供了研究靶點(diǎn)。
　　第一部分 C2ORF40與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性研究
　　[目的]
　　檢測臨床上乳腺癌病人病例組織樣本中C2ORF40的表達(dá)水平，并進(jìn)一步探究乳腺腫瘤病人病例組織中C2ORF40表達(dá)水平與相關(guān)臨床病理特征間的關(guān)聯(lián)，明確C2ORF40在乳腺癌中的臨床意義，同時(shí)為更全面探索C2ORF40在乳腺癌中的作用及機(jī)制奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　[方法]

9、r>　　1.收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的乳腺癌組織及其相對應(yīng)對應(yīng)的癌旁組織，分別經(jīng)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)測C2ORF40在乳腺腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織中轉(zhuǎn)錄水平，經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測乳腺腫瘤組織及其癌旁組織中C2ORF40蛋白水平。
　　2.采用Alenabio生物科技公司的乳腺癌組織芯片(BC081116C)，應(yīng)用免疫組化染色實(shí)驗(yàn)來對正常乳腺組織、原位乳腺癌組以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中C2ORF40蛋白表達(dá)水平

10、進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析C2ORF40表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度及其TNM分期等乳腺癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)。
　　[結(jié)果]
　　1.采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測C2ORF40在乳腺腫瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織中轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示與乳腺腫瘤癌旁組織相比，C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平在乳腺腫瘤組織中顯著降低。
　　2.采用Western blot實(shí)驗(yàn)對C2ORF40在乳腺腫瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織中的蛋白表達(dá)水

11、平進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明與相應(yīng)的乳腺癌旁組織中C2ORF40蛋白表達(dá)水平相比，腫瘤組織中C2ORF40表達(dá)水平發(fā)生了明顯降低。
　　3.取乳腺癌組織芯片經(jīng)免疫組化染色實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)C2ORF40蛋白在正常乳腺組織、原位乳腺癌組織以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)情況，結(jié)果表明C2ORF40蛋白于正常乳腺組織中表達(dá)水平較高，在原位腫瘤組織中C2ORF40蛋白表達(dá)水平發(fā)生明顯下調(diào)，而在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤組織中C2ORF40蛋白水平最低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)

12、，C2ORF40表達(dá)水平與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及TNM分期等臨
　　床病理學(xué)特征緊密相關(guān)。
　　[結(jié)論]
　　1.在正常乳腺組織中C2ORF40轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明較高，而其表達(dá)情況在腫瘤組織中則則發(fā)生了顯著下調(diào)，提示C2ORF40在乳腺腫瘤中屬于抑癌基因。
　　2.免疫組化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，與正常乳腺組織中C2ORF40蛋白表達(dá)情況相比，原位癌組織中C2ORFR40表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)，在有轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤組織

13、中其表達(dá)水平最低。進(jìn)一步分析表明乳腺癌患者C2ORF40表達(dá)水平且與其相應(yīng)腫癌臨床病理特征密切相關(guān)。
　　第二部分 C2ORF40及其衍生物抗腫瘤作用研究
　　[目的]
　　第一部分臨床病例研究表明C2ORF40在乳腺癌中表達(dá)水平降低，且與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移、分化程度及其TNM分期等緊密相關(guān)。本部分我們通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)異種移植瘤模型深入研究C2ORF40及其衍生物抗腫瘤作用及其作用機(jī)制。
　　[方法]
　　1.

14、通過生物科技公司Synpeptide（Shanghai，China）合成C2ORF40衍生物即小分子多肽C2ORF40 mimic peptide(C2ORF40MPF)及其對照Scrambled C2ORF40mimic peptide(ScrC2ORF40)。
　　2.應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細(xì)胞增殖能力的作用。
　　3.應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞，通過Transwel

15、l遷移實(shí)驗(yàn)檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細(xì)胞遷移能力的作用。
　　4.應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞，采用Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測C2ORF40MPF多肽對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的作用。
　　5.應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)MDA-MB-231細(xì)胞系建立裸鼠移植瘤模型，并給予C2ORF40MPF多肽進(jìn)行治療，從而通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證C2ORF40MPF能否抑制乳腺腫瘤的生長。
　　6.構(gòu)建C2ORF40基因過表達(dá)質(zhì)粒（pBabe-C2ORF4

16、0），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染pBabe-C2ORF40及其對照空白質(zhì)粒，我們前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系BT549和MDA-MB-231中C2ORF40表達(dá)水平較低，從而選用上述細(xì)胞系來構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)C2ORF40的細(xì)胞株及其對照細(xì)胞株(BT549-pBabe，BT549-pBabe-C2ORF40，MDA-MB-231-pBabe，MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40)。應(yīng)用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，然后采用RT-PCR和Western b

17、lot方法來驗(yàn)證我們所建立的細(xì)胞系中C2ORF40的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。
　　7.應(yīng)用以上篩選獲得的穩(wěn)定過表達(dá)C2ORF40的BT549和MDA-MB-231細(xì)胞株及相應(yīng)空白對照細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)來檢測C2ORF40是否調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期。
　　8.應(yīng)用C2ORF40穩(wěn)定高表達(dá)及其空白對照乳腺癌細(xì)胞株，將細(xì)胞周期同步化技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)方法相結(jié)合，更深入闡明C2ORF4是如何調(diào)控細(xì)胞周期。
　　9.采用乳腺癌

18、細(xì)胞系經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測C2ORF40MPF多肽是否對腫瘤細(xì)胞周期有作用;并將細(xì)胞同步化技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從而更深入闡明C2ORF40MPF多肽細(xì)胞周期的調(diào)控作用。
　　10.應(yīng)用穩(wěn)定高表達(dá)及其空白對照C2ORF40的乳腺癌細(xì)胞株，通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)來檢測過表達(dá)C2ORF40對有絲分裂進(jìn)程的具體作用。
　　[結(jié)果]
　　1.成功構(gòu)建并合成C2ORF40衍生物C2ORF40MPF及其對照ScrC2ORF40

19、。
　　2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C2ORF40MPF多肽可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞的增殖能力。
　　3.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明C2ORF40MPF多肽能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞遷移。
　　4.Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C2ORF40MPF可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力。
　　5.異種移植瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)C2ORF40MPF能夠在體內(nèi)明顯抑制乳腺腫瘤的生長。
　　6.成功構(gòu)建過表達(dá)C2

20、ORF40的質(zhì)粒(pBabe-C2ORF40)，并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2ORF40的乳腺癌細(xì)胞BT549和MDA-MB-231（分別命名:BT549-pBabe，BT549-pBabe-C2ORF40; MDA-MB-231-pBabe,MDA-MB-231-pBabe-C2ORF40）。通過RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上細(xì)胞系確實(shí)得構(gòu)建成功。
　　7.應(yīng)用C2ORF40穩(wěn)定高表達(dá)及其空白對照細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)

21、果表明高表達(dá)C2ORF40使細(xì)胞周期中G2/M期增多。
　　8.應(yīng)用C2ORF40穩(wěn)定高表達(dá)及其空白對照乳腺癌細(xì)胞株，將細(xì)胞同步化處理與流式細(xì)胞術(shù)方法相結(jié)合，結(jié)果顯示C2ORF40誘導(dǎo)產(chǎn)生有絲分裂阻滯。
　　9.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)C2ORF40MPF多肽能明顯增加腫瘤細(xì)胞G2/M期比例再將細(xì)胞同步化實(shí)驗(yàn)與流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合進(jìn)一步證實(shí)其對細(xì)胞周期阻滯作用。
　　10.應(yīng)用C2ORF40穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞系，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)

22、果表明C2ORF40將細(xì)胞周期阻滯在有絲分裂前中期并造成多核細(xì)胞生成增多，該項(xiàng)結(jié)果有力證實(shí)了C2ORF40對有絲分裂的阻滯作用。
　　[結(jié)論]
　　1.C2ORF40及其C2ORF40衍生物對細(xì)胞周期有調(diào)控作用，通過將細(xì)胞周期阻滯在有絲分裂前中期并造成多核細(xì)胞增多，干擾細(xì)胞有絲分裂過程，對腫瘤細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用。
　　2.C2ORF40衍生物能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　第三部分 C2ORF

23、40調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制研究
　　[目的]
　　以上研究表明C2ORF40在乳腺癌中具有明顯的抗腫瘤作用，且在腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮了明顯的調(diào)控作用，但是其作用機(jī)制尚不明確，本部分我們通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究C2ORF40抗腫瘤作用的具體分子機(jī)制。
　　[方法]
　　1.利用GEO基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫經(jīng)過生物信息學(xué)技術(shù)分析C2ORF40可能的靶基因;應(yīng)用我們建立的穩(wěn)定過表達(dá)C2ORF40的腫瘤細(xì)胞株其空白對照細(xì)胞，通過

24、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證上述分析結(jié)果。
　　2.應(yīng)用建立的過表達(dá)C2ORF40的乳腺癌細(xì)胞系及其空白對照細(xì)胞株，通過Western blot實(shí)驗(yàn)方法來檢測C2ORF40對有絲分裂基因的影響。
　　3.構(gòu)建BIRC5高表達(dá)質(zhì)粒（p3xflag-cmv-10-BIRC5），在高表達(dá)C2ORF40乳腺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染BIRC5質(zhì)粒，經(jīng)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BIRC5的表達(dá)水平變化;進(jìn)一步經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

25、BIRC5是否能改變C2ORF40對細(xì)胞周期的影響。
　　4.通過Alenabio生物科技公司的乳腺癌組織芯片(BC081116C)，采用免疫組化染色實(shí)驗(yàn)來檢測BIRC5蛋白在正常乳腺組織、原位腫瘤組織以及有轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)情況的變化，并進(jìn)一步經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其表達(dá)水平與對應(yīng)標(biāo)本中C2ORF40表達(dá)水平之間的相關(guān)性。
　　[結(jié)果]
　　1.經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)C2ORF40的作用基因大部分是重要的有絲分裂相關(guān)基因

26、。
　　2.經(jīng)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，C2ORF40能夠降低有絲分裂基因BIRC5的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中回調(diào)BIRC5水平能夠部分逆轉(zhuǎn)C2ORF40引起的細(xì)胞周期阻滯作用。
　　3.組織芯片的免疫組化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與正常乳腺組織相比，BIRC5在腫瘤組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C2ORF40的表達(dá)水平和BIRC5的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。
　　[結(jié)論]<