抗腫瘤小分子化合物作用機(jī)制的初步研究及抗腫瘤藥物對線粒體活性氧產(chǎn)生的影響.pdf

1、目的:(1)癌癥已成為嚴(yán)重危害人類健康和生命的罪魁禍?zhǔn)字?。目前，化療是治療癌癥的主要手段之一。因此，研發(fā)高效低毒的抗癌藥物仍是攻克癌癥的首要策略。本論文初步探究目標(biāo)化合物(targetcompounds)的抗癌機(jī)制，為其的后續(xù)篩選、研發(fā)等提供理論和實(shí)驗(yàn)參考。(2)超氧陰離子（superoxideanion,O2(-)）是活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要存在形式之一，在細(xì)胞分化、衰老、凋亡以及多種疾病中

2、起重要作用?；谡n題組自制的超高靈敏流式檢測裝置(highsensitivityflowcytometer,HSFCM)在靈敏度方面的獨(dú)特優(yōu)勢，本研究嘗試建立一種單線粒體水平線粒體O2(-)分析的新方法。
　　方法:(1)通過流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)和免疫印跡法(Westernblotting)初步研究目標(biāo)化合物的抗癌效果及其作用機(jī)制。以HL-60細(xì)胞為模型，目標(biāo)化合物刺激后，AlexaFluor(R)48

3、8AnnexinV/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率;熒光探針MitoSOX和羅丹明123分別檢測線粒體O2(-)含量和線粒體膜電位的變化。同時，Westernblotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-9和PARP)的活化;目標(biāo)化合物直接刺激線粒體，Westernblotting檢測細(xì)胞色素C(cytochromec，Cytc)的釋放。(2)抗腫瘤藥物刺激HeLa細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體O2(-)和總ROS含量的變化。不同呼吸

4、底物存在時，抗腫瘤藥物直接刺激提純的線粒體，HSFCM檢測O2(-)含量的變化。
　　結(jié)果:(1)AnnexinV/PI雙染法表明目標(biāo)化合物均能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且具有濃度依賴性;后續(xù)結(jié)果表明這些化合物能引起線粒體膜電位降低、O2(-)含量增加、Cytc的釋放、Caspase-9和PARP的激活，因此它們可通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)細(xì)胞水平研究表明ABT-737幾乎不能誘導(dǎo)O2(-)或總ROS的產(chǎn)生;叔丁基過氧化氫(

5、tert-butylhydroperoxide，TBHP)能誘導(dǎo)總ROS顯著升高但對線粒體O2(-)含量無影響;其它藥物（抗霉素A、魚藤酮、樺木酸、紫杉醇、星形胞菌素、維生素K）都能在不同程度上促進(jìn)線粒體總ROS及O2(-)含量的升高。線粒體水平研究表明:抗霉素A、樺木酸、紫杉醇、星形孢菌素都能促進(jìn)線粒體O2(-)含量升高;ABT-737、TBHP、維生素K對O2(-)含量均無影響;呼吸底物蘋果酸鹽和谷氨酸鹽存在時，魚藤酮誘導(dǎo)O2(-)