賴氨大黃酸的制備及其抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類健康的第二大殺手，在某些地區(qū)已上升為頭號殺手，世界每年死于惡性腫瘤的人數(shù)呈逐年遞增的趨勢。開發(fā)新型抗腫瘤藥物將是人類戰(zhàn)勝惡性腫瘤的重要手段之一。近年來，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對腫瘤形成過程中的受體、基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有了比較深入的了解，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的靶向治療獲得了突破性的進(jìn)展，靶向藥物的研究是當(dāng)前臨床研究最活躍的領(lǐng)域之一，其中靶向蛋白酪氨酸激酶的藥物已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一種能選擇性地使

2、不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的一種酶，大致可分為受體酪氨酸激酶、非受體酪氨酸激酶、IR和Janus激酶等。在病理?xiàng)l件下PTKs會持續(xù)活化，阻斷其對細(xì)胞分化、生長和凋亡等的調(diào)節(jié)功能，誘發(fā)腫瘤。 據(jù)報道受體PTKs家族中超過50％的成員發(fā)生與人類惡性腫瘤相關(guān)的突變或者過度表達(dá)，其中30％的成員與人類實(shí)體腫瘤相關(guān)。EGFR家族是受體PTKs中重要成員，其包括4個成員，分別是EGFR(ErbB-1，HER-1)、HER-2(ErbB-2)

3、、HER-3(ErbB-3)和HER-4(ErbB-4)。在全世界每年診斷的150萬新增乳腺腫瘤患者中，27％-30％與EGFR的過度表達(dá)有關(guān)，20％-25％與HER-2的過度表達(dá)有關(guān)。單純針對EGFR或者HER-2的單克隆抗體或蛋白酪氨酸激酶抑制劑(TKI)存在很大局限性，針對單靶點(diǎn)的藥物在腫瘤治療方面有效率不足30％，雖然與其它藥物聯(lián)用可以在一定程度上提高藥物療效，但是通過受體酪氨酸激酶活性的相互補(bǔ)充，很快產(chǎn)生耐藥。因此開發(fā)針對EG

4、FR和HER-2雙靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑將會提高腫瘤治療的療效。蛋白酪氨酸激酶的抑制劑-大黃素能夠通過抑制HER-2的自身磷酸化和交互磷酸化，阻斷ErbB-2的酪氨酸激酶活性。對HER-2過度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞采用大黃素處理能夠降低酪氨酸的過度磷酸化，提高細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性，本文研究同為大黃蒽醌類化合物的大黃酸是否對EGFR和HER-2蛋白酪氨酸激酶活性起到雙重抑制作用。 大量文獻(xiàn)報道大黃中的三種葸醌類化合物大黃酸、大黃

5、素和蘆薈大黃素能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等多方面的抗腫瘤活性。但是由于其水溶性低，生物利用度差，目前除應(yīng)用其瀉下作用外，其它藥理活性還沒有應(yīng)用于臨床。大黃酸與大黃中其它葸醌類化合物最顯著的區(qū)別就是大黃酸存在一個游離的羧基，因此我們選擇大黃酸的羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。 第一部分以增加水溶性為目標(biāo)的大黃酸衍生物制備 目的：通過對大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備出水溶性好的大黃酸衍生物或其

6、鹽。 方法：方法一，在特定反應(yīng)條件下，通過大黃酸與賴氨酸反應(yīng)生成賴氨酰大黃酸，借助賴氨酸存在的游離氨基和羧基增加賴氨酰大黃酸在水中的溶解度。方法二，在一定反應(yīng)條件下，通過賴氨酸與大黃酸之間的酸堿反應(yīng)生成穩(wěn)定的鹽，增加大黃酸在水中的溶解度。通過MTT方法檢測產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性。 結(jié)果：按照方法一獲得了黃色和紫紅色兩種產(chǎn)物，其中黃色產(chǎn)物不溶于水，紫紅色產(chǎn)物水溶性好，對兩種產(chǎn)物進(jìn)行了紅外光譜測定，證明兩種產(chǎn)物均為大黃酰賴氨酸

7、甲酯，應(yīng)用MTT方法檢測了這兩種產(chǎn)物體外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)二者的體外抗腫瘤活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃酸，而且其產(chǎn)率也比較低，分別為6％和9％，因此沒有進(jìn)行進(jìn)一步研究。按照方法二獲得了水溶性好的紫色產(chǎn)物，經(jīng)過紫外分光光度法、HPLC法和紅外光譜法驗(yàn)證此產(chǎn)物為賴氨大黃酸鹽(RHL)，通過MTT方法證實(shí)RHL與大黃酸具有同等的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性。 結(jié)論：大黃酰賴氨酸甲酯雖然能夠部分改善大黃酸水溶性差的缺點(diǎn)，但是其體外抗腫瘤活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃酸，沒

8、有對其進(jìn)一步研究。RHL不僅解決了大黃酸水溶性難的問題，而且其抗腫瘤活性與大黃酸相當(dāng)，有進(jìn)一步開發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力。 第二部分賴氨大黃酸體外抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究 目的：觀察RHL體外抗腫瘤作用，探討其分子作用機(jī)制。 方法：通過MTT檢測細(xì)胞增殖，Westernblot檢測受體PTKs通路蛋白表達(dá)水平及其磷酸化水平的變化，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測EGFR和HER-2蛋白表達(dá)水平變化，RT-PCR檢測HER-2在基因轉(zhuǎn)

9、錄水平上的變化，流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。 結(jié)果：RHL抑制不同來源的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、SK-Br-3和MDA-MB-231)、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖，IC50分別為95μmol/L、80μmol/L、110μmol/L、85μmol/L和200μmol/L。而且RHL在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面與大黃酸相近。對RHL抗腫瘤機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)：在EGFR高表達(dá)和HER-

10、2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，其通過抑制EGFR的磷酸化及其下游Raf/MEK/ERK信號通路的磷酸化抑制細(xì)胞增殖，并且其與紫杉醇等其它化療藥物聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用；在EGFR和HER-2高表達(dá)的SK-Br-3細(xì)胞，其能夠抑制EGFR和HER-2蛋白表達(dá)和蛋白磷酸化水平，并且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過p53和p21途徑發(fā)生細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：RHL是新型的靶向EGFR和HER-2雙靶點(diǎn)的受體蛋白酪氨酸激酶抑制劑。通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞

11、凋亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。 第三部分賴氨大黃酸體內(nèi)抗腫瘤活性及其與紫杉醇的協(xié)同作用 目的：觀察RHL體內(nèi)抗腫瘤活性和探討其與紫杉醇協(xié)同抗腫瘤作用的機(jī)制。 方法：建立小鼠肝癌和人類腫瘤裸鼠移植模型，分別采用灌胃、腹腔注射途徑給藥，觀察小鼠對藥物的耐受情況和藥物的抗腫瘤活性。并通過免疫組化方法觀察腫瘤組織EGFR蛋白磷酸化水平變化。 結(jié)果：RHL單獨(dú)用藥有一定的抑制腫瘤生長作用。采用腹腔注射方法給藥優(yōu)于灌胃給藥

12、。其與紫杉醇合用，在小鼠H22肝癌和MCF-7乳腺癌裸鼠移植瘤模型均表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。免疫組化研究結(jié)果表明RHL能夠抑制由紫杉醇引起的EGFR和ERK蛋白磷酸化水平升高。 結(jié)論：RHL體內(nèi)應(yīng)用抑制小鼠H22肝癌和人類乳腺癌裸鼠移植瘤生長，腹腔注射途徑給藥比灌胃給藥有更高抑瘤率。在小鼠H22肝癌和人類乳腺癌裸鼠移植瘤，RHL與Taxol聯(lián)合有協(xié)同抗腫瘤作用。 總結(jié)：本文通過對大黃酸的改造獲得了水溶性好的RHL。RHL抑