向日葵花盤抗腫瘤有效組分篩選及其活性機(jī)制研究.pdf

1、向日葵在我國種植廣泛，向日葵花盤、葉、莖稈等副產(chǎn)品資源來源豐富，但一般都作為飼料、燃料或廢棄物處理，不但污染環(huán)境，而且嚴(yán)重浪費(fèi)資源，工業(yè)附加值極低。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域中向日葵具有極高的藥用價值，全株均可入藥，具有防治癌癥、降血壓、提高免疫力等多種療效，目前對其藥用組分及相關(guān)功能活性的確證研究稀少。因此，研究和開發(fā)向日葵資源藥用組分，對于深入探索向日葵藥用組分的活性功能，促進(jìn)向日葵資源中藥現(xiàn)代化利用具有重要意義。
　　本文研究了向日葵

2、（除籽之外）資源藥用組分分布和積累規(guī)律，針對向日葵抗腫瘤活性組分進(jìn)行了篩選，并對其抗腫瘤活性作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期對向日葵藥用資源和抗腫瘤活性組分的開發(fā)利用提供依據(jù)，主要研究結(jié)果如下：
　　(1)以總多酚、總黃酮、總多糖和綠原酸為研究目標(biāo)，對向日葵各個生長階段的藥用組分在植株內(nèi)的分布和積累規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，以多糖為采收目的物質(zhì)應(yīng)選擇成熟期花盤，除此之外，向日葵藥用資源的采集應(yīng)首選花期的向日葵花盤和現(xiàn)蕾期的葉。
　　(

3、2)采用勻漿萃取法分別制備了報道或驗(yàn)方中提及的具有抗腫瘤活性的向日葵植株部位——根、莖髓和花盤總提取物，其中花盤總提取物得率最高，為13.33％。對向日葵花盤提取物按照極性大小進(jìn)行分級處理，獲得了二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4個極性段萃取物，其中水萃取物得率最高，其次為二氯甲烷萃取物。
　　(3)通過MTT法和S180荷瘤鼠模型考察了向日葵根、莖髓和花盤總提取物，以及向日葵花盤二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取

4、物、正丁醇萃取物和水萃取物4個極性段萃取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果表明，花盤總提取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性是各部位提取物中最好的，而二氯甲烷萃取物的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性均優(yōu)于向日葵花盤提取物，因此判斷二氯甲烷萃取物是向日葵花盤提取物中抗腫瘤活性最好的藥用組分。
　　(4)通過人類胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)法以及Western-blot法研究了向日葵花盤二氯甲烷萃取物(HHDE)的抗腫瘤作用

5、機(jī)制，結(jié)果表明，HHDE具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，且其抗腫瘤活性的劑量相關(guān)性顯著大于時間相關(guān)性，作用濃度≥0.25mg/mL時24h即可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑制率≥58％。伴隨著HHDE濃度的增加，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡均可以觀察到劑量相關(guān)的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，Annexin-Ⅴ-FITC/PI法和細(xì)胞周期檢測結(jié)果均顯示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的凋亡，同時線粒體膜電位下降，ROS、Ca2+水平顯著升高。Western-blot結(jié)果顯示

6、線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C表達(dá)下降，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C表達(dá)增加，表明細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時Caspase-3、Caspase-9前體蛋白表達(dá)下降，證明Caspase-3、Caspase-9已經(jīng)被激活。另外，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)上升，Bax/Bcl-2比例上升。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HHDE抗腫瘤作用機(jī)制主要是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。
　　(5)通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法對HH

7、DE的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)果表明HHDE中可能含有包括8個倍半萜類化合物，6個二萜類化合物的14種化合物成分，其中文獻(xiàn)報道grandifloric acid具有顯著抗腫瘤活性，其余化合物未見相關(guān)報道。
　　(6)通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法從HHDE中鑒定出35種化合物，占HHDE總揮發(fā)性物質(zhì)的93.26％。含量最高的8種化合物占HHDE總揮發(fā)性物質(zhì)的63.26％。綜合文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，并通過MTT法驗(yàn)證茴芹內(nèi)酯、海松酸和β