海洋微生物抗腫瘤活性菌株的篩選及其活性物質(zhì)的研究.pdf

1、海洋由于其特殊的生態(tài)環(huán)境，具有豐富的生物物種資源，而這些生物物種蘊(yùn)藏著許多寶貴的生物活性物質(zhì)，海洋微生物由于特異性強(qiáng)、易于發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)逐漸為人們所重視，成為研究的熱點(diǎn)。本文用MTT法對(duì)來源于海洋的251株細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞毒活性物質(zhì)的篩選，并對(duì)高活性菌株No.657的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，為深入開發(fā)利用海洋微生物資源提供依據(jù)。主要結(jié)論如下:
　　 1.采用MTT法對(duì)分離自美國(guó)圣璜島海域的251株海洋細(xì)菌進(jìn)行了抗腫瘤活性的篩選，結(jié)果顯

2、示，54株海洋菌有較好的抗腫瘤活性，在測(cè)試濃度為100μg/mL時(shí)，對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率均大于50％，占總測(cè)試菌株的21.5％，其中有7株菌株對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率在85％以上。在所有活性菌株中，菌株No.657的活性最強(qiáng)，其液體發(fā)酵及固體發(fā)酵的提取物，對(duì)HeLa細(xì)胞的IC50分別為36.53μg/mL、3.19μg/mL，固體發(fā)酵較適合于該菌株活性物質(zhì)的產(chǎn)生。
　　 2.對(duì)菌株No.657進(jìn)行菌株形態(tài)的觀察和16SrDNA序

3、列分析，鑒定該菌株為變形斑沙雷式菌Serratia proteamaculans。
　　 3.以發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性及產(chǎn)量為指標(biāo)，初步確定了對(duì)菌株No.657固體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件:溫度20-23℃，培養(yǎng)基初始pH值6-7;并且對(duì)培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化，通過N=12的Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響活性物質(zhì)產(chǎn)生的4個(gè)重要因子，并對(duì)該4個(gè)因子設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，得到重要性順序?yàn)?NaCl＞蛋白胨＞MgSO4＞酵母

4、粉，最佳培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10.0g、酵母粉1.0g、NaCl19.45g，MgSO40g。
　　 4.菌株No.657按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行批量發(fā)酵，并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步研究。通過薄層層析法和硅膠柱層析法對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，薄層層析法確定硅膠柱層析的流動(dòng)相為二氯甲烷-甲醇體系，分離條件為純二氯甲烷，二氯甲烷與甲醇比例100:1，98:1，95:1，90:1，70:1,40:1,20:1，純甲醇梯度洗脫。對(duì)柱層析分