AFMK對(duì)牙乳頭細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、牙胚的發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期的、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，是上皮和神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)相互作用的結(jié)果。內(nèi)釉上皮下方的牙乳頭細(xì)胞(dental papillacells，DPCs)具有分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的潛能，與牙本質(zhì)的形成和維持有著密切的關(guān)系，是研究牙齒發(fā)育和牙髓損傷修復(fù)的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 褪黑素(melatonin，MT)是松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其分泌具有晝夜節(jié)律性。MT不僅調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、性成熟及生殖、免疫反應(yīng)、腫瘤

2、及衰老，而且還調(diào)節(jié)毛發(fā)及骨骼等器官的發(fā)育，并可誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。視交叉上核是哺乳類動(dòng)物周期活動(dòng)的起點(diǎn)，調(diào)節(jié)松果體及其它器官的周期性活動(dòng)，對(duì)牙本質(zhì)節(jié)律性的生成有重要影響。最近研究發(fā)現(xiàn)，鐘狀晚期的牙乳頭細(xì)胞表達(dá)褪黑素受體MT1。本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)：MT影響牙乳頭細(xì)胞的增殖和分化。
　　 N1-乙酰基-N2-甲?；?5-甲氧基犬尿胺(N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxy kynuramine，A

3、FMK)是MT肝外途徑代謝的主要產(chǎn)物之一，與MT具有相同的活性基團(tuán)，屬于犬脲胺家族中的一員，通過(guò)酶、光化學(xué)及自由基等多種途徑生成，在免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面與MT具有相似的功能。目前，AFMK有關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬在體外培養(yǎng)、鑒定牙乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探討MT代謝產(chǎn)物AFMK對(duì)大鼠牙乳頭細(xì)胞增殖、分化以及基質(zhì)礦化等方面的影響，為進(jìn)一步闡明牙乳頭細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制提供新思路。
　　 目的：體外培養(yǎng)、鑒定大鼠牙乳頭細(xì)

4、胞；利用AFMK刺激體外培養(yǎng)的牙乳頭細(xì)胞，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、分化以及基質(zhì)礦化的影響，為闡明牙乳頭細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制提供新思路。
　　 材料和方法：
　　 ①截取出生1天(day，d)的Sprague-Dewley(SD)大鼠的下頜骨第一磨牙段，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色確認(rèn)牙胚所處的發(fā)育階段。牙乳頭細(xì)胞傳代純化后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；采用SP法對(duì)細(xì)胞行波形絲蛋白和角蛋白染色，鑒定來(lái)源；繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；檢測(cè)礦化條件

5、下細(xì)胞牙本質(zhì)涎蛋白(dentinsialoprotein，DSP)的表達(dá)。
　　 ②用AFMK分別在DMEM培養(yǎng)基(AFMK濃度為1×10-25、1×10-23、1×10-21mol/l)和礦化誘導(dǎo)液(AFMK濃度為1×10-23、1×10-21、1×10-19mol/l)條件下刺激牙乳頭細(xì)胞，分別在第1、2、3、4d，MTT比色法檢測(cè)各組OD值。
　　 ③應(yīng)用堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)

6、試劑盒，檢測(cè)AFMK(1×10-17、1×10-15、1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞2d時(shí)ALP活性。
　　 ④應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞10d時(shí)DSP的表達(dá)。
　　 ⑤用AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞21d，分別行Von Kossa和茜素紅染色，前者倒置相差顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)，后者加入濃度為1％的鹽酸酒精，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。
　　

7、 結(jié)果：
　　 ①牙乳頭組織來(lái)源于鐘狀晚期的第一磨牙牙胚；純化的牙乳頭細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白陰性；牙乳頭細(xì)胞增殖穩(wěn)定，生長(zhǎng)良好，在礦化誘導(dǎo)液條件下表達(dá)DSP。
　　 ②MTT結(jié)果顯示：DMEM培養(yǎng)基條件下，第1、2d時(shí)，各組OD值變化不顯著(P＞0.05)。第3d時(shí)，1×10-23mol/l組OD值較對(duì)照組及1×10-27mol/l組顯著增高(P＜0.05)，其余各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。第4d時(shí)，1×1

8、0-23mol/l組OD值較對(duì)照組及1×10-27mol/l組顯著增高(P＜0.05)，1×10-25mol/l組OD值較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)，其余各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；礦化誘導(dǎo)液條件下，第1d時(shí)，OD值隨著AFMK濃度的增加有降低趨勢(shì)，各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。第2d時(shí)，1×10-19mol/l、1×10-21mol/l組OD值均較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，其余各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。第3

9、d時(shí)，實(shí)驗(yàn)各組OD值均較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。第4d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OD值均較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，并且1×10-19mol/l組OD值較1×10-21、1×10-23mol/l組顯著降低(P＜0.05)，其余各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 ③高濃度AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞2d，ALP活性較對(duì)照組顯著增高(P＜0.05)。
　　 ④AF

10、MK(1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞10d，DSP呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，染色陽(yáng)性部位在胞漿，呈棕黃色顆粒，對(duì)照組呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 ⑤AFMK(1×10-13mol/l)刺激牙乳頭細(xì)胞21d，Von Kossa染色可見(jiàn)橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，與對(duì)照組相比礦化基質(zhì)形成的量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 ①對(duì)來(lái)源于鐘狀晚期的大鼠牙乳頭細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，成功獲取純化的、功能活性正常的牙乳頭細(xì)胞。