透明質(zhì)酸對脂肪干細胞增殖和分化的影響.pdf

1、成體干細胞(adult stem cells，ASCs)分布廣泛、增殖力強且具有多向分化潛能，一直是組織工程“種子細胞”研究的熱點。其中，以骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)研究最多，應用最廣。但其純化率較低且數(shù)量有限，難以滿足臨床應用的需求；取材時對機體造成的創(chuàng)傷較大；而且骨髓中干細胞的比例、增殖能力都會隨年齡的增長和骨質(zhì)疏松的發(fā)生逐漸下降，因此探索一種新的組織工程“種子細胞”十分必要。

2、脂肪組織再生能力強，體內(nèi)儲量豐富，取材創(chuàng)傷小，細胞可大量獲取，有望成為最重要的種子細胞來源庫。自2001年Zuk等在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能的、成纖維細胞樣的干細胞以來，相繼在包括人類在內(nèi)的多個物種的研究結(jié)果表明其具有多向分化能力。脂肪干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)有望成為組織工程的“種子細胞”之一。 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是近年來發(fā)現(xiàn)的大

3、分子酸性粘多糖，廣泛存在于人體內(nèi)，譬如它是顳下頜關節(jié)滑液和關節(jié)軟骨基質(zhì)的重要成分，以鈉鹽的形式存在，即透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate，SH)，起潤滑關節(jié)的作用。透明質(zhì)酸可減小組織間的摩擦，緩沖咀嚼對關節(jié)軟骨的壓力，營養(yǎng)軟骨，保護受損的軟骨細胞，同時具有鎮(zhèn)痛止血的效果。顳下頜關節(jié)紊亂病患者滑液中透明質(zhì)酸的含量明顯減少，軟骨細胞及滑膜細胞受損程度明顯增加。另外有研究表明透明質(zhì)酸可以增強體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞及滑膜細胞的分泌

4、功能并可延長其壽命。 眾所周知，干細胞在經(jīng)體外長期培養(yǎng)后，其增殖活性和分化能力都會有所降低。雖然ADSCs在體外傳代能力較BMSCs強，但隨著傳代的增加，其增殖活性和分化能力也會有所降低。迄今為止，尚無一種可靠的方法可以促進ADSCs增殖和分化。本實驗以小型豬ADSCs為實驗細胞，透明質(zhì)酸為作用物質(zhì)，檢測透明質(zhì)酸對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs增殖和分化潛能的積極影響，并進一步探索一種較為理想的延長體外培養(yǎng)干細胞壽命及增強其分化能力

5、的手段。 第一部分 透明質(zhì)酸對脂肪干細胞增殖活性的影響 目的: 1.研究透明質(zhì)酸對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs增殖活性的影響，為組織工程種子細胞壽命的延長奠定理論基礎和實驗依據(jù)。 2.探索增強體外培養(yǎng)小型豬ADSCs增殖活性的透明質(zhì)酸的最適宜濃度。 方法： 實驗分組：A．對照組(基礎培養(yǎng)基)；B．低濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA0.01mg/ml)：C．中濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA 0.1mg/ml

6、)；D．高濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA 1.0mg/ml)。 實驗步驟：3-5代小型豬ADSCs體外培養(yǎng)1周，消化傳代接種至24孔板上，培養(yǎng)1天，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。分別加入基礎培養(yǎng)基、含不同濃度透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、7、14、21天觀察細胞形態(tài)；傳代檢測傳代后細胞的生長情況；同時MTT法檢測其生長增殖情況并繪制生長曲線。本實驗數(shù)據(jù)值以-X±S表示，多組間比較采用重復測量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢

7、驗進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.透明質(zhì)酸作用于ADSCs后，細胞形態(tài)、生長曲線等發(fā)生改變，增殖活性受到影響。 2.各實驗組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)發(fā)生變化。高濃度組細胞成簇狀生長，不能完全伸長，細胞呈多突起星形。低、中濃度組細胞形態(tài)較好，呈典型的長梭形(成纖維細胞樣)。14天及21天時細胞形態(tài)及數(shù)量發(fā)生明顯差別，高、低濃度

8、組培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)一些雜質(zhì)細胞及脂肪細胞，胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴，部分細胞形態(tài)呈多角形或圓形，細胞生長緩慢；中濃度組及對照組細胞形態(tài)仍較好，生長良好。 3.細胞傳代后貼壁時間組間有差異；中濃度組細胞貼壁最早，貼壁時間約為4小時。高、低濃度組的貼壁時間均長于對照組。 4.MTT法繪制生長曲線結(jié)果顯示各組ADSCs在傳代后均經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期；總體來說，中濃度組細胞生長最快，高濃度組細胞生長最慢，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學

9、意義(P<0.05)，但低濃度組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結(jié)論： 不同濃度的透明質(zhì)酸對ADSCs的增殖作用不同，當培養(yǎng)液中透明質(zhì)酸的濃度為0.1mg/ml時，對ADSCs的生長增殖具有促進作用；透明質(zhì)酸濃度為1mg/ml時，降低ADSCs的增殖活性；濃度為0.01mg/ml時，與對照組比較，無明顯差異。 第二部分 透明質(zhì)酸對脂肪干細胞分化能力的影響 目的： 1.研究透明質(zhì)酸

10、對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs分化能力的影響，為組織工程種子細胞分化能力的提高奠定理論基礎和實驗依據(jù)。 2.探索增強體外培養(yǎng)小型豬ADSCs分化能力的透明質(zhì)酸的最適宜濃度。 方法： 實驗分組：A．對照組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基)；B．低濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 0.01mg/ml)；C．中濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 0.1mg/ml)；D．高濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 1.0mg/ml)。 實驗步驟：3-5

11、代小型豬ADSCs體外培養(yǎng)1周，消化傳代接種至24孔板，培養(yǎng)1周，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。分組加入傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基，含高、中、低濃度透明質(zhì)酸的誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、7、14、21天觀察細胞形態(tài)；培養(yǎng)14天后油紅O、蘇丹黑B染色鑒定成脂誘導效果；Von kossa、茜素紅染色及ALP活性檢測鑒定成骨誘導效果。堿性磷酸酶定量檢測數(shù)據(jù)值以-X±S表示，多組間比較采用重復測量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計

12、軟件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.透明質(zhì)酸作用于ADSCs后，其仍保持向脂肪細胞和成骨細胞分化的能力。 2.加入各組成脂誘導培養(yǎng)基后，所有組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮巍E圓形，于誘導的第7天開始細胞胞質(zhì)內(nèi)有脂滴形成，以后逐漸增多。油紅。及蘇丹黑B染色結(jié)果顯示高濃度組脂滴形成效率明顯高于低、中濃度組，低、中濃度組又高于對照組。 3.

13、加入各組成骨誘導培養(yǎng)基后，所有組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切?，于誘導的第5天開始細胞呈集簇狀生長。Von kossa、茜素紅染色及ALP染色結(jié)果顯示高濃度組礦化結(jié)節(jié)形成效率明顯高于對照組，低、中濃度組略高于對照組，ALP活性檢測結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論： 透明質(zhì)酸作用于成脂誘導、成骨誘導的ADSCs后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，分化效率受到影響。實驗中三個濃度的透明質(zhì)酸對體外培養(yǎng)的ADSCs的成脂