骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-透明質(zhì)酸復(fù)合物對放射性潰瘍創(chuàng)面愈合的影響.pdf

1、目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞—透明質(zhì)酸復(fù)合物對大鼠放射性潰瘍創(chuàng)面的影響及其可能的作用機制。 方法：①分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29，CD31，CD44，CD45，以明確分離培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。通過體外誘導(dǎo)使其分化為脂肪細(xì)胞，采用油紅0染色鑒定分化的脂肪細(xì)胞，證實MSCs的多向分化潛能。②將透明質(zhì)酸與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞懸液在生物載體上的擴(kuò)散程度來判斷透明質(zhì)酸載體親

2、水性大小，通過觀察細(xì)胞懸液在生物載體上是否飄動來判斷透明質(zhì)酸載體對細(xì)胞粘附力，并檢測MSCs的細(xì)胞表面標(biāo)志、細(xì)胞周期及分化為脂肪細(xì)胞的潛能。③采用Sr—90皮膚敷貼器，以45Gy劑量體外照射SD大鼠臀部兩側(cè)皮膚，造成放射性皮膚潰瘍動物模型，觀察大鼠皮膚創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，檢測創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量，判斷愈合情況。④將MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物移植入皮膚創(chuàng)面，比較MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物組、透明質(zhì)酸組、空白對照組的創(chuàng)面愈合率，HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察

3、，Ⅷ因子免疫組化進(jìn)行微血管計數(shù)，檢測創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量判斷愈合質(zhì)量。熒光顯微鏡下觀察CM—DiI標(biāo)記MSCs，以檢測MSCs的遷移分布。 結(jié)果：⑴采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，原代細(xì)胞經(jīng)過24h后可見大量細(xì)胞貼壁生長，48～72h后開始伸展，6～8d后貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞生長進(jìn)入指數(shù)生長期。傳代細(xì)胞生長至第3代后，細(xì)胞形態(tài)漸趨一致。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異抗

4、原CD29和CD44呈高表達(dá)，不表達(dá)CD31和CD45。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，油紅0染色陽性，保持了成脂分化的潛能。⑵透明質(zhì)酸與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)顯示，透明質(zhì)酸具有較強的親水性，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的吸附力強。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物細(xì)胞表面標(biāo)志物與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一致。MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物保持了成脂分化的潛能。細(xì)胞周期分析顯示，MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物G1+G2期細(xì)胞為94.2％，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞G1

5、+G2期細(xì)胞為95.5％，提示均為低分化細(xì)胞，符合干細(xì)胞特性。⑶采用Sr—90皮膚敷貼器體外照射大鼠皮膚45min，劑量為45Gy，可導(dǎo)致大鼠放射性皮膚潰瘍。照射2～3周后，局部皮膚出現(xiàn)潰瘍。照射后5周潰瘍不再增大。照射后6～9周，潰瘍周圍可見新生上皮長入，傷口收縮遲緩。創(chuàng)面羥脯氨酸含量較正常對照皮膚顯著降低。⑷MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物移植到創(chuàng)面后，熒光顯微鏡下可見CM—DiI標(biāo)記的MSCs。MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物組創(chuàng)面愈合率、羥脯氨

6、酸含量顯著高于透明質(zhì)酸組和對照組，Ⅷ因子免疫組化陽性細(xì)胞增多，微血管計數(shù)顯著高于透明質(zhì)酸組和對照組，組織學(xué)觀察顯示，MSCs—透明質(zhì)酸復(fù)合物移植術(shù)后2～3周，可見表皮新生。Masson染色可見膠原纖維平行于創(chuàng)面排列。 結(jié)論：①MSCs體外培養(yǎng)生長穩(wěn)定，傳代后仍保持未分化狀態(tài)，具有多分化潛能。②透明質(zhì)酸與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)，未改變MSCs的特性及體外分化能力，且透明質(zhì)酸與MSCs組織相容性好，對MSCs無毒性作用。③采用Sr—90皮