Osteopontin調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞促進糖尿病創(chuàng)面愈合的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　近年來研究發(fā)現(xiàn),骨髓基質(zhì)中除造血干細胞外,還存在另一類能夠分化為多種骨髓間質(zhì)成分的干細胞,它被廣義地定義為骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),其具有自我更新分化增殖和多向分化潛能的特點,在一定的環(huán)境和刺激因子作用下可分化為間充質(zhì)組織細胞如骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞和脂肪細胞等,且在體外培養(yǎng)過程中始終保持著多向分化的潛能。因此,在組織工程、細胞和基因治療中作為主要的種子細胞越來越引起人們的關(guān)注。
　　Osteopo

2、ntin(骨橋蛋白,OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白,也被稱為早期T淋巴細胞激活物1,最早于1979年被發(fā)現(xiàn),1985年,Franzen等在大鼠礦化的骨基質(zhì)中分離出一種含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)序列的磷酸化糖蛋白,命名為osteopontin。OPN含有特異地與細胞貼附有關(guān)的RGD序列,通過與其受體整合素或者細胞表面CD44等結(jié)合來促進細胞的趨化、黏附和遷移。OPN能調(diào)節(jié)與炎癥反應(yīng)和免疫疾病相關(guān)的淋巴細胞的黏附和細胞因子的

3、產(chǎn)生?，F(xiàn)有研究表明,OPN參與了皮膚的正常生理和病理過程。在大鼠皮膚組織中,OPN選擇性表達于毛發(fā)生長初期的毛囊真皮乳頭細胞內(nèi)。并且,OPN與角膜成纖維細胞的黏附和遷移有關(guān),在創(chuàng)口的愈合過程中OPN為正性調(diào)節(jié),還調(diào)節(jié)肌成纖維細胞和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達,表明OPN調(diào)節(jié)了創(chuàng)口愈合相關(guān)的成纖維細胞的行為。另外,在皮膚表皮層以及纖維化的肝肺組織、皮膚角化癥等病變組織中也可以檢測到OPN的表達,并可能通過影響皮膚角質(zhì)細胞的增殖分化改變了細胞外

4、基質(zhì)的微環(huán)境,在皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。Mori等系統(tǒng)研究了OPN與皮膚創(chuàng)口炎癥反應(yīng)的關(guān)系,結(jié)果顯示OPN促進創(chuàng)口愈合,致肉芽組織減少,瘢痕減輕,并發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)可以誘導(dǎo)OPN的表達。也有研究發(fā)現(xiàn)OPN能促使單核細胞分泌IL-1β等炎性因子。IL-l是皮膚中重要的前炎癥介質(zhì),以無活性的前體存在于角質(zhì)形成細胞(keratinocyte,KC)胞質(zhì)中,

5、當皮膚受損時,受損的KC修飾并釋放活化IL-1β,后者經(jīng)IL-1受體激活KC,誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生GM-CSF、TNF-α、TGF-α、IL-6、雙調(diào)蛋白、ICAM-1、整聯(lián)蛋白、纖維連接蛋白。另外,IL-1β作為一種旁分泌信號可激活真皮中的內(nèi)皮細胞,使之表達選擇素,后者作為淋巴細胞的一種化學引誘物,可使淋巴細胞溢出脈管游走至損傷處。因此,OPN可能成為皮膚傷口愈合速度和質(zhì)量的潛在靶點,在糖尿病慢性創(chuàng)面愈合中可能發(fā)揮重要作用。
　　目的:

6、
　　本文試圖研究OPN通過調(diào)控MSCs促進糖尿病創(chuàng)面愈合的作用。
　　方法:
　　1、以C57野生型和OPN基因敲除型(OPN-/-)小鼠為研究對象,并分別提取兩組小鼠骨髓,分離并培養(yǎng)MSCs細胞,用流式細胞術(shù)等方法進行鑒定并標記為MSCs和OPN-/-MSCs。
　　2、利用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法誘發(fā)糖尿病,并通過皮膚打孔進一步建立糖尿病創(chuàng)面模型,分成A組(OPN基因敲除組):OPN-/-糖尿病鼠

7、接受OPN-/-MSCs移植);B組(對照組):野生型糖尿病鼠接受緩沖液移植;C組(野生型組):野生型糖尿病鼠接受MSCs移植,觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合情況。
　　3、利用HE染色、免疫組化、免疫熒光、RT-PCR和Westernblot等方法,觀察各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織愈合時形態(tài)、微血管數(shù)量及OPN基因局部表達變化,以明確OPN基因在干細胞表達的差異對皮膚創(chuàng)面愈合的影響。
　　結(jié)果:
　　我們成功分離和培養(yǎng)了野生型和OPN

8、-/-型兩組小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并建立了糖尿病小鼠創(chuàng)面模型;對照組創(chuàng)面完全愈合用了19.90±0.55天,OPN基因敲除小鼠OPN-/-MSCs注射組完全愈合用了18.52±0.75天,野生型小鼠MSCs注射組完全愈合用了13.70±0.35天。野生型創(chuàng)面愈合時間明顯短于OPN敲除型(p<0.05)。經(jīng)免疫熒光、RT-PCR和Western blot檢測證實了OPN基因在野生型組創(chuàng)面愈合真皮的表達顯著,局部新生微血管密度增加明顯,而在