骨髓間充質(zhì)干細胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響及作用機制研究.pdf

1、糖尿病的發(fā)病率逐年升高，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。目前全球糖尿病患者已經(jīng)達到2.2億人，糖尿病已經(jīng)成為影響人類健康和生活質(zhì)量的重大疾病。糖尿病分為兩種類型，它們一個共同的特點是胰島B細胞的減少。目前臨床用于β細胞替代治療的方法主要有胰腺移植和胰島移植，但這兩種方法都存在供體緊缺和免疫排斥的缺點，仍不能大規(guī)模推廣。近年來研究發(fā)現(xiàn)胰島具有再生的潛能，通過促進自身胰島再生來治療糖尿病已經(jīng)成為研究的一個熱點。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓移植能降低糖尿病小鼠血

2、糖，促進糖尿病小鼠胰島的再生。與骨髓細胞相比，骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)具有擴增能力強、免疫原性低等優(yōu)點，是細胞移植的理想來源。本研究首先對比了BMSC和骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cell，BMMC)對糖尿病小鼠胰島功能的影響，觀察胰島再生的途徑；然后觀察：BMSC在糖尿病小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸；最后闡明BMSC移植后改善糖尿病小鼠胰島功

3、能的旁分泌機制以及參與胰島再生的信號轉(zhuǎn)導通路。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細胞移植對糖尿病小鼠胰島功能的影響以及胰島再生的途徑。
　　方法：通過鏈脲霉菌素(streptozotocin，STZ)腹腔內(nèi)注射建立小鼠糖尿病模型。隨機分成3組，分別為STZ組(尾靜脈注射PBS)、BMMC組(尾靜脈注射骨髓單個核細胞)、BMSC組(尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞)，移植后

4、每周檢測血糖變化，移植后1周和6周檢測小鼠胰腺形態(tài)學、Insulin染色，并統(tǒng)計胰島數(shù)目、胰島β細胞數(shù)目，并通過檢測胰腺組織中Brdt，和胰腺干細胞的標記物(BrdU、PDX-1、Ngn3等)表達情況，了解胰島再生的途徑。
　　結果：①血糖變化：STZ組小鼠血糖一直呈上升趨勢；移植后第4周，BMMC組小鼠血糖出現(xiàn)顯著下降(19.8±5.8mmol/L)，并持續(xù)下降至第6周(18.7±5.2mmol/L)，分別與STZ組(27.3±

5、1.3mmol/L，27.5±1.1mmol/L，)比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.01)；移植后第1周，BMSC組小鼠血糖就出現(xiàn)顯著下降(20.0±7.6 mmol/L)，與STZ組(26.1±3.1mmol/L)和BMMC組(25.2±2.8mmol/L)相比有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.05)，血糖持續(xù)下降至移植后第6周，此時血糖濃度為16.5±5.7mmol/L，與STZ組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，但與

6、BMMC組比較無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。②胰島數(shù)目變化：移植后1周，STZ組小鼠胰島數(shù)目為11.3±4.1個；BMMC細胞組小鼠胰島數(shù)目為12.8±5.0個，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；而BMSC組小鼠胰島數(shù)目為21.6±7.6個，與STZ組和BMMC組小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.01)。移植后6周，STZ組小鼠胰島數(shù)目仍較少(15.4±5.3個)，BMMC組小鼠胰島數(shù)增加(23.7±5.4個)，與

7、STZ組比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，而BMSC組小鼠胰島數(shù)目也顯著增加(26.0±9.4個)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。③胰島B細胞變化；移植后1周，STZ組小鼠胰島p細胞數(shù)目較少(143.94±29.2個)，BMMC組小鼠胰島β細胞數(shù)也較少(155.3±98.9個)，而BMSC組小鼠胰島β細胞數(shù)較多(320.6±67.6個)，與STZ組和BMMC組比較均有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.01)。移植后

8、6周，STZ組小鼠胰島β細胞數(shù)進一步減少(82.1±33.0個)，而BMMC組小鼠胰島β細胞數(shù)增加(523.6±150.2個)，與STZ組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，BMSC組胰島β細胞數(shù)繼續(xù)增多(553.6±242.2個)，與STZ組比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。說明BMSC移植能改善糖尿病小鼠的胰島功能，促進胰島B細胞的再生。④胰腺組織相關標記物的表達：在BMMC組和BMSC組小鼠胰腺組織中發(fā)現(xiàn)胰島β細胞的增殖，即發(fā)現(xiàn)同時

9、表達Insulin和BrdU的細胞；還發(fā)現(xiàn)了胰島干細胞，如同時表達PDX-1和BrdU，但不表達Insulin的細胞；發(fā)現(xiàn)Ngn3陽性的細胞；發(fā)現(xiàn)同時表達Insulin和Glucagon的細胞。而對照組未發(fā)現(xiàn)上述細胞。⑤TUNEL染色：在STZ組小鼠胰腺組織中發(fā)現(xiàn)較多陽性細胞，即胰島凋亡細胞增加，而在BMMC組和BMSC組胰島中陽性細胞較少，即凋亡細胞較少。
　　結論：BMSC移植修復糖尿病小鼠胰島功能的效果優(yōu)于BMMC；BMSC

10、移植促進糖尿病小鼠胰島再生的途徑既包括胰島細胞自身增殖也包括胰島干細胞的分化；BMSC移植抑制糖尿病小鼠胰島細胞凋亡。
　　第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細胞在糖尿病小鼠體內(nèi)的分布及能否轉(zhuǎn)分化為胰島β細胞。
　　方法：將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞移植至糖尿病小鼠體內(nèi)，檢測小鼠胰腺中GFP陽性細胞的表達

11、以及GFP與胰腺發(fā)育過程中相關標記物的表達情況。
　　結果：移植后6周，在受體鼠胰腺組織中可見較多的GFP陽性的細胞，特別是在胰腺的胰島及其周圍，以及胰腺導管周圍。在受體鼠胰腺組織內(nèi)，除了極少數(shù)GFP陽性細胞表達Insulin(幾千個GFP細胞中只有2個)，絕大多數(shù)GFP陽性細胞并不表達Insulin，也未發(fā)現(xiàn)同時表達GFP和胰腺發(fā)育過程中相關標記物如Nestin、Ngn3、PDX-1、NeuroD、Nkx2.2、NKX6.1、P

12、ax4、Pax6的細胞。
　　結論：外源性BMSC能遷移至損傷的胰腺組織內(nèi)，特別是胰島和胰腺導管周圍；BMSC移植后血糖的降低并不是由BMSC分化為胰島B細胞所致。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復糖尿病胰島功能的旁分泌機制研究
　　目的：闡明骨髓間充質(zhì)干細胞移植修復糖尿病小鼠胰島功能的旁分泌機制及參與胰島再生的信號通路。
　　方法：旁分泌機制實驗：①體內(nèi)實驗：將糖尿病小鼠分為三組：STZ組(尾靜脈注射空培養(yǎng)

13、基)、BMSC組(尾靜脈注射BMSC)、BMSC-CM組(尾靜脈注射BMSC-CM)，分別觀察血糖變化及胰島數(shù)、胰島β細胞數(shù)變化。②體外實驗：將STZ損傷的小鼠胰島分為2組：STZ組、BMSC-CM組(加入BMSC-CM共培養(yǎng))，了解胰島細胞形態(tài)及BrdU表達情況。信號通路機制實驗：①體內(nèi)實驗：將糖尿病小鼠分成兩組：STZ組、BMSC組，檢測胰島組織中pAkt、pErk的表達變化。②體外實驗：首先，將STZ損傷的小鼠胰島分成2組STZ組

14、、BMSC-CM組，了解胰島細胞pAkt、pErk的表達變化。其次，用LY294002、PD98059分別將Akt、Erk信號通路阻斷后，再觀察胰島細胞形態(tài)及BrdU表達情況。再次，將Akt信號通路阻斷后，觀察pAkt的表達。
　　結果：旁分泌機制實驗：①血糖變化：STZ組小鼠血糖一直呈上升趨勢。移植后第1周，BMSC組血糖出現(xiàn)顯著下降(20.0±7.6mmol/L)，并一直持續(xù)下降至移植后第6周(16.5±5.7mmol/L)，

15、與STZ組(26.1±3.1mmol/L，27.5±1.1mmol/L)比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05，p<0.01)。移植后第1周，BMSC-CM組血糖也出現(xiàn)明顯下降(17.5±4.1 mmol/L)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，與BMSC組比較差異無統(tǒng)計學意義(p<0.05)，并一直持續(xù)至第6周(11.6±4.9mmol/L)，與STZ組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。②胰島細胞和β細胞數(shù)變化：移植

16、后6周，STZ組小鼠胰島數(shù)目仍較少(15.4±5.3個)，胰島β細胞數(shù)也較少(82.1±33.0個)；BMSC組小鼠胰島數(shù)目增加(26.0±9.4個)，胰島β細胞數(shù)目也增加(553.6±242.2個)，與STZ組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.01)；BMSC-CM組小鼠胰島數(shù)目較多(32.3±6.2個)，胰島β細胞數(shù)目也較多(621.0±106.1個)，與STZ組比較差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.01)，與B

17、MMC組相比無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。③體外實驗發(fā)現(xiàn)BMSC-CM和胰島細胞共培養(yǎng)后，胰島BrdU陽性細胞數(shù)明顯增多。信號通路機制實驗：體內(nèi)、外實驗表明BMSC組小鼠胰島細胞pAkt、pErk的表達上調(diào)。PI3K阻滯劑LY294002和MEK1阻滯劑PD98059分別阻斷兩條信號通路后，在STZ組、BMSC組、PD98059組胰島中發(fā)現(xiàn)BrdU陽性的細胞，而在LY294002組和LY294002+PD98059組胰島中未發(fā)現(xiàn)BrdU

18、陽性的細胞，而且其胰島細胞團體積較小，這就表明只有阻斷Akt通路才能遏制胰島細胞增殖。Insulin和BrdU免疫熒光雙染色，結果發(fā)現(xiàn)BMSC-CM組和PD98059組胰島中同時表達Insulin和BrdU的細胞較多，即增殖的胰島β細胞較多。Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)，加入BMSC-CM后pAkt的表達顯著上調(diào)，但加入LY294002后，即使加入BMSC-CM也不能上調(diào)pAkt。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，胰島細胞和BMSC-C

19、M共培養(yǎng)后，Notch1基因顯著下調(diào)。
　　結論：BMSC移植通過旁分泌作用修復糖尿病小鼠的胰島；BMSC移植通過Akt通路促進糖尿病小鼠胰島的增殖；BMSC移植可能通過Notch通路促進糖尿病小鼠胰島干細胞的分化。
　　結論
　　1.BMSC移植能促進糖尿病小鼠胰島的增殖和胰島干細胞的分化，效果優(yōu)于BMMC移植。
　　2.BMSC移植通過旁分泌機制修復糖尿病小鼠的胰島。
　　3.BMSC移植通過Akt通路