骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成肌腱分化促進(jìn)肌腱愈合的實驗研究.pdf

1、背景：
　　肌腱損傷在日常生活及運動領(lǐng)域十分常見，由于肌腱組織解剖結(jié)構(gòu)特殊，其內(nèi)血管供給較少，自身修復(fù)愈合能力較差，愈合后容易出現(xiàn)瘢痕及鈣化等并發(fā)癥。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)已開始用于促進(jìn)肌腱修復(fù)的研究，但有部分病例存在異位鈣化并發(fā)癥及干細(xì)胞形成腫瘤的風(fēng)險等。因此，本課題組提出，采用生長因子體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成肌腱分化后，體外構(gòu)建干細(xì)胞肌腱替代生物材料用于肌腱損傷的修復(fù)。
　　目的：
　　1、

2、分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。
　　2、研究生長因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成肌腱分化的調(diào)控及最佳條件。
　　3、體外構(gòu)建干細(xì)胞肌腱替代生物材料。
　　4、研究干細(xì)胞肌腱替代生物材料是否能促進(jìn)肌腱缺損愈合。
　　方法：
　　1、采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)綠熒光大鼠BMSCs，流式細(xì)胞儀技術(shù)和成骨、成軟骨、成脂肪分化實驗進(jìn)行鑒定。
　　2、取第3代的BMSCs，加入不同濃度的生長分化因子6（G

3、DF-6），生長分化因子7（GDF-7）和結(jié)締組織生長因子（CTGF），體外誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，實時熒光定量PCR檢測scleraxis和tendomodulin基因mRNA的表達(dá)。根據(jù)PCR結(jié)果篩選出每個生長因子的最佳濃度。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測tendomodulin、tenascinC和I型膠原的表達(dá)；Westernblotting檢測tendomodulin蛋白的表達(dá)。篩選出生長因子調(diào)控BMSCs體外成肌腱分化的最佳條件。
　　

4、3、取第3代的BMSCs，誘導(dǎo)成肌腱分化2周后，體外構(gòu)建干細(xì)胞肌腱替代生物材料植入裸鼠皮下，12周后取材，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢測。
　　4、動物模型：SD大鼠髕腱缺損模型。將BMSCs和干細(xì)胞肌腱替代生物材料分別填充髕腱缺損處，對照組不植入任何細(xì)胞或材料。術(shù)后2、4、6周取材，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)。術(shù)后4周取材，進(jìn)行生物力學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，本實驗分離培養(yǎng)的BMSCs，CD90、CD44表達(dá)陽性，C

5、D31、CD34表達(dá)陰性，并具有成骨、成軟骨和成脂肪分化的多向分化能力。
　　2、實時熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Westernblotting結(jié)果顯示，CTGF（25ng/ml）和GDF-6（20ng/ml）能顯著增加tenomodulin和scleraxis的mRNA表達(dá)（p<0.05）及tenomodulin、tenascinC和I型膠原的蛋白表達(dá)。
　　3、組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，干細(xì)胞肌腱替代生物材料可在裸鼠

6、體內(nèi)形成肌腱樣組織，其膠原纖維染色呈紅色，密集平行排列，細(xì)胞沿張力方向縱行排列于膠原纖維之間。
　　4、組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，干細(xì)胞肌腱替代生物材料組在各個時間點的愈合情況明顯好于BMSCs組和對照組，細(xì)胞明顯減少，膠原纖維明顯增多且排列趨向平行。生物力學(xué)分析結(jié)果顯示，干細(xì)胞肌腱替代生物材料組的最大應(yīng)力和彈性模量顯著大于BMSCs組和對照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、經(jīng)鑒定，本實驗分離培養(yǎng)的BMSCs具有

7、多向分化能力，并表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物。
　　2、GDF-6，GDF-7和CTGF三種生長因子均能誘導(dǎo)BMSCs成肌腱分化，其中CTGF25ng/ml和GDF-620ng/ml兩種條件分化效果更好。
　　3、BMSCs在體外經(jīng)過CTGF（25ng/ml）誘導(dǎo)成肌腱分化后，可在體外構(gòu)建干細(xì)胞肌腱替代生物材料。該材料在裸鼠體內(nèi)可形成肌腱樣組織。
　　4、經(jīng)過成肌腱分化過程構(gòu)建的干細(xì)胞肌腱替代生物材料，可顯著促進(jìn)大