機(jī)械拉伸作用調(diào)節(jié)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱成纖維細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腱/韌帶是堅(jiān)韌的結(jié)締組織,它們通過其結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)和外形的變化以響應(yīng)外力的刺激,在運(yùn)動中起著重要作用,但活動范圍超過極限或拉扯過劇,腱/韌帶常常會受到損傷甚至斷裂,嚴(yán)重影響人們的健康。腱/韌帶損傷的治療目前仍然是整形外科中具有挑戰(zhàn)性的問題,比如如何加快治療速度、提高治療質(zhì)量直至完全治愈等等,都是臨床上亟待解決的難題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是一類具有增殖和多向分化潛能的特殊細(xì)胞群。在某些特異

2、誘導(dǎo)條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可增殖并分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等。這種分化可塑性為彌補(bǔ)臨床上腱/韌帶組織的缺乏帶來了希望,使腱/韌帶創(chuàng)傷的更好治療甚至組織工程化成為可能。但關(guān)于力學(xué)加載調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱成纖維細(xì)胞定向分化的研究工作,至今尚未見詳細(xì)報(bào)道。為此,本文研制一種細(xì)胞體外拉伸加載的裝置,研究機(jī)械拉伸對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的調(diào)節(jié)作用,尋找調(diào)節(jié)骨髓干細(xì)胞定向分化為腱/韌帶成纖維細(xì)胞的機(jī)械拉伸加載條件

3、,并采用分子生物學(xué)等手段對分化過程中的標(biāo)志基因CollagenI(ColI)、CollagenIII(ColIII)、Tenascin(TNC)、Scleraxis(SCX)的表達(dá)變化進(jìn)行定量描述。主要研究工作和結(jié)果如下:①大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ratbone marrowme senchymalstem cells,rMSCs)的原代分離培養(yǎng)利用密度梯度離心結(jié)合差異貼壁法進(jìn)行rMSCs的原代分離培養(yǎng),結(jié)果表明:1.073g/ml的pe

4、rcoll密度梯度離心結(jié)合差異貼壁分離得到的細(xì)胞為形態(tài)比較均一的單核細(xì)胞,用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后細(xì)胞開始貼壁,繼而分裂增殖,呈集落式生長,約2周后接近融合,呈紡錘形或長梭形的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。其間有漂浮不貼壁的造血細(xì)胞等雜細(xì)胞,在反復(fù)換液中被除去。傳代后細(xì)胞貼壁、生長較快,約一周可達(dá)到融合,呈長梭形或紡錘形均勻分布。考馬斯亮藍(lán)觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)骨架蛋白呈藍(lán)色束狀

5、,而且其走向和細(xì)胞長軸平行。②rMSCs的鑒定和周期分析利用免疫染色方法考察了分離培養(yǎng)的細(xì)胞表面部分抗原的表達(dá),利用流式細(xì)胞技術(shù)分析了細(xì)胞周期的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細(xì)胞表面抗原CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)呈陰性;CD44和CD29呈陽性表達(dá)。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞占(89.74±3.87)%,S期細(xì)胞占(2.49±2.2)%,G2/M期細(xì)胞占(7.7±3.7)%,表明大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。③機(jī)械拉伸加載裝置的加工制作根據(jù)基底膜

6、形變原理,自行研制了單軸細(xì)胞拉伸裝置。實(shí)驗(yàn)裝置由控制系統(tǒng)、機(jī)械系統(tǒng)、電機(jī)系統(tǒng)、冷卻系統(tǒng)和培養(yǎng)腔五個部分組成,實(shí)現(xiàn)拉伸-保持-恢復(fù)-保持-拉伸的單軸周期性拉伸加載方式。系統(tǒng)的綜合評價表明:該裝置運(yùn)行穩(wěn)定,溫度可控,拉伸頻率及應(yīng)變大小可調(diào)(頻率范圍0.01-1.5HZ,應(yīng)變范圍0-50%),拉伸時間人為控制,操作簡便,可對細(xì)胞進(jìn)行不同頻率、時間和應(yīng)變大小的拉伸加載。④拉伸加載對rMSCs向肌腱成纖維細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)本文考察了rMSCs在頻

7、率0.1Hz、形變大小10%的單軸縱向周期拉伸加載條件下的形態(tài)變化和相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明:持續(xù)拉伸加載24h,rMSCs排列開始發(fā)生變化,拉伸48h,細(xì)胞變得細(xì)長,其排列方向和拉伸方向成60o至90o夾角,大部分細(xì)胞垂直于受力方向排列。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),和對照組(同樣條件的靜態(tài)培養(yǎng))比較,拉伸加載24h,ColI和ColIII表達(dá)明顯增加,但實(shí)驗(yàn)組和對照組均沒有表達(dá)TNC和SCX。拉伸加載48h,ColI和ColIII的表達(dá)回到

8、對照組水平,但TNC和SCX在拉伸組rMSCs中表達(dá),而對照組不表達(dá)TNC和SCX。結(jié)果表明,拉伸加載24h,ColI和ColIII在rMSCs中的表達(dá)迅速增加;拉伸加載48h,肌腱細(xì)胞特異標(biāo)記基因TNC和SCX等開始表達(dá),表明rMSCs向肌腱成纖維細(xì)胞定向分化。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了大鼠肌腱成纖維細(xì)胞的原代分離培養(yǎng),檢測了大鼠肌腱細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)情況。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌腱成纖維細(xì)胞大量表達(dá)ColI和ColIII,弱表達(dá)TNC和S