大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基通過ERK1-2促進肌腱細胞增殖.pdf

1、間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是一類非造血干細胞，不僅來源廣泛而且具有一定的可塑性以及可以誘導分化為不同類型的細胞，如成骨細胞和基質(zhì)細胞等。MSCs通過分化參與組織損傷修復的能力使其成為臨床上最具應用前景的干細胞類型之一。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，MSCs不僅可以通過定向分化替代受損組織，而且還可以通過旁分泌作用參與損傷修復。
　　肌腱損傷是臨床常見的疾病之一。基于干細胞的肌腱損傷修復研究

2、表明，多種因素可以誘導干細胞向肌腱細胞定向分化，包括細胞因子、力學拉伸、共培養(yǎng)環(huán)境等。但是，雖然有報道表明MSCs旁分泌可促進多種組織的損傷修復，但MSCs旁分泌作用是否參與肌腱損傷修復目前還未有報道。
　　本文的主要研究目的是探究大鼠骨髓MSCs條件培養(yǎng)基（conditionedmediumfromratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells,rMSCs-CM）對大鼠肌腱細胞增殖的影響以及信號

3、分子ERK1/2（extracellularregulatedproteinkinases1/2,ERK1/2）在此過程中的作用及其對肌腱細胞細胞周期的影響。具體的工作內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　①大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、肌腱細胞分離與培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（ratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells,rMSCs）的原代培養(yǎng)：全骨髓分離法體外分離提取SD大鼠rMSCs。倒置相差顯微鏡觀察到rMSCs

4、細胞形態(tài)均一，呈梭形或三角形，核質(zhì)明顯，集落呈旋渦狀等。流式細胞儀對rMSCs細胞表面抗原鑒定結(jié)果顯示，96.9％的細胞CD90陽性，92.9%的細胞CD44陽性，1.13%的細胞CD34陰性，檢測結(jié)果符合間充質(zhì)干細胞的基本特征。
　　肌腱細胞的原代培養(yǎng)：用組織塊培養(yǎng)法提取SD大鼠前腳趾肌腱，20天左右后進行傳代培養(yǎng)。肌腱細胞形態(tài)呈長梭形纖維狀形態(tài)、折光性強、細胞核明顯。②rMSCs-CM對肌腱細胞增殖的影響課題組預實驗表明，rM

5、SCs-CM處理24h、48h和72h對肌腱細胞的增殖均具有促進作用，但促增殖效果差異不大，故本課題主要針對rMSCs-CM處理24h對肌腱細胞增殖的影響進行研究。采用細胞計數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24h后，rMSCs-CM處理組肌腱細胞數(shù)量顯著高于對照組，約為對照組的1.5倍，細胞周期檢測顯示，rMSCs-CM處理組細胞的增值指數(shù)PI顯著高于對照組，提示rMSCs-CM處理24h能顯著促進肌腱細胞增殖。
　?、踨MSCs-CM通過激活

6、ERK1/2促進肌腱細胞增殖研究發(fā)現(xiàn)，rMSCs-CM處理15、30、60、90和120min均能顯著刺激肌腱細胞p-ERK1/2的表達，其中15min激活最強烈，表達量約為對照組的1.8倍（p<0.01），提示rMSCs-CM可能通過激活ERK1/2信號通路促進肌腱細胞增殖。ERK1/2的抑制劑PD98059（50μM）能顯著抑制rMSCs-CM促進的肌腱細胞ERK1/2磷酸化。對肌腱細胞增殖情況的檢測發(fā)現(xiàn)，PD98059能顯著抑制r