關(guān)于Shh協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的:造血干細(xì)胞(HSCs)的體外擴(kuò)增一直是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，近年來關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)促進(jìn)HSCs增殖的研究較多。我們前期研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSC促進(jìn)骨髓增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管增生明顯，前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSC促進(jìn)HSC增殖，Snoic hedgehog(Shh)協(xié)同MSC促進(jìn)HSC的增殖。本研究將進(jìn)一步探討MSC促進(jìn)HSC增殖是否與促血管生成因子有關(guān)，Shh協(xié)同MSC促進(jìn)HSC增殖的機(jī)制。本研究可以為骨髓HSC體外擴(kuò)增方面

2、的深入研究提供依據(jù)，這對(duì)造血干細(xì)胞移植(HSCT)的發(fā)展及血液系統(tǒng)惡性疾病的治療可能有著良好的應(yīng)用前景。
　　方法:①抽取健康志愿者的骨髓，根據(jù)MSCs貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)MSCs傳至第三代(P3)，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，加用人抗鼠CD105-FITC、CD34-ECD、CD45-PCy7三種抗體鑒定MSC的純度及表面標(biāo)記。②抽取的骨髓采用密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)，然后使用miniMASC磁珠分選

3、儀分離CD34+細(xì)胞并通過計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，加用人抗鼠CD34-ECD、CD45-PEcy7和人抗鼠IgG1-ECD、CD45-PEcy7，F(xiàn)CM檢測(cè)HSCs純度。③使用Transwell小室(上室微網(wǎng)孔徑0.4um)非接觸培養(yǎng)P3代的MSC及CD34+細(xì)胞，分為:HSC+MSC組和HSC組兩組，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3、7、10天分別收集HSC樣本計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞增殖速度最快，故我們將培養(yǎng)第7天作為本研究的時(shí)間點(diǎn)。④使用Transwel

4、l小室及24孔板，非接觸共培養(yǎng)及單獨(dú)培養(yǎng)P3代的MSCs與骨髓CD34+細(xì)胞，并用Shh干預(yù)，分組如下:共培養(yǎng)分為:HSC+MSC組和HSC+MSC+Shh組，單獨(dú)培養(yǎng)分為:HSC組、MSC組、HSC+Shh組、MSC+Shh組。⑤非接觸共培養(yǎng)，在Transwell上、下室分別接種HSC和MSC，含Shh組，在Transwell的下室加入Shh蛋白，不含Shh組，則不加;單獨(dú)培養(yǎng)組，在普通24孔板中分別加入與非接觸共培養(yǎng)組相同數(shù)量的HS

5、C或MSC，含Shh組，在24孔板中加入含Shh的培養(yǎng)基，不含Shh組，則不加;培養(yǎng)至7天收集樣本。⑥檢測(cè)HSC、MSC細(xì)胞計(jì)數(shù)、RNA總量、熒光定量PCR(Q-PCR)結(jié)果:先使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各組三個(gè)復(fù)孔HSC和MSC的細(xì)胞數(shù)目;然后采用TRIZOL法提取各組三個(gè)復(fù)孔HSC和MSC RNA的含量;再將各組提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA放-20℃保存;最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測(cè)以下Q-PCR結(jié)果: HSC: Ki67、Tie-2，

6、MSC: VEGF、Ang-1的mRNA水平的表達(dá)，Q-PCR結(jié)果使用2-△△Ct分析法來進(jìn)行相對(duì)定量(RQ)分析。⑦實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):我們采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)中所獲得的數(shù)據(jù)，兩兩比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）”表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)，則差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:①全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的MSC，顯微鏡下可見MSC呈梭形，成旋渦狀排列，貼壁生長(zhǎng);FCM鑒定P3代細(xì)胞的MSC，結(jié)

7、果顯示:MSCs高表達(dá)CD105，低表達(dá)CD34和CD45，比例分別為52.4％、2.2％、0.3％，MSCs的純度為52.4％。②利用Mini MACS分離裝置分選出的HSC，鏡下呈圓形，流式鑒定結(jié)果顯示CD34+細(xì)胞的純度為81.9％。③培養(yǎng)HSC+MSC和HSC3、7、10天統(tǒng)計(jì)HSC的數(shù)量，HSC組10天＞7天＞3天，HSC+MSC組10天＞7天＞3天，HSC的計(jì)數(shù)均增加，在培養(yǎng)7天后，HSC計(jì)數(shù)增加速度最快，說明共培養(yǎng)最佳作用

8、時(shí)間為第7天。④我們統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)第7天各組HSC和MSC的計(jì)數(shù)。培養(yǎng)第7天，各培養(yǎng)組HSC的計(jì)數(shù):HSC+Shh組、HSC+MSC組都高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且HSC+MSC+Shh組高于HSC+MSC組;P值均＜0.05。各培養(yǎng)組MSC的計(jì)數(shù):MSC+Shh組、MSC+HSC組都高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且MSC+HSC+Shh組高于MSC+HSC組;P值均＜0.05。⑤培養(yǎng)第7天，采用TRIZOL法提取HSC和MSC RNA的含量。各組HSC

9、的RNA總量:HSC+Shh組、HSC+MSC組都高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且HSC+MSC+Shh組高于HSC+MSC組;P值均＜0.05。各培養(yǎng)組MSC的RNA總量:MSC+Shh組、MSC+HSC組都高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且MSC+HSC+Shh組高于MSC+HSC組;P值均＜0.05。⑥培養(yǎng)第7天，利用Q-PCR法分別檢測(cè)HSC的Ki67、Tie-2和MSC的VEGF、Ang1mRNA的相對(duì)表達(dá)量，即RQ值。Ki67的RQ值:HSC

10、+SHH組、HSC+MSC組都高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且HSC+MSC+Shh組高于HSC+MSC組;P值均＜0.05。Tie-2的RQ值:HSC+SHH組、HSC+MSC組都高于HSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且HSC+MSC+Shh組高于HSC+MSC組;P值均＜0.05。⑦培養(yǎng)第7天，各培養(yǎng)組MSC的VEGF的RQ值:MSC+SHH組、MSC+HSC組都高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且MSC+HSC+Shh組高于MSC+HSC組;P值均＜0.05。Ang

11、1的RQ值: MSC+SHH組、MSC+HSC組都高于MSC單獨(dú)培養(yǎng)組;且MSC+HSC+Shh組高于MSC+HSC組;P值均＜0.05。
　　結(jié)論:1.我們成功的分離培養(yǎng)出MSC、利用Mini MACS分離裝置成功的分離培養(yǎng)出HSC;2.研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC能夠促進(jìn)HSC的增殖，Shh能夠促進(jìn)HSC的增殖，且Shh協(xié)同MSC促進(jìn)HSC的增殖，本研究結(jié)果與前期研究一致;3.MSC促進(jìn)HSC增殖的作用機(jī)制與血管生成因子有關(guān);3.Shh