骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對(duì)MHC半相合造血干細(xì)胞移植aGVHD影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：HLA半相合造血干細(xì)胞移植可以使大部分患者找到親緣移植供者，但因病人易發(fā)生致命的GVHD常導(dǎo)致移植失敗，使其應(yīng)用受到限制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，能夠分泌多種細(xì)胞因子參與造血微環(huán)境的組成，為造血干細(xì)胞的分裂、增殖、分化提供適合的環(huán)境，并在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細(xì)胞移植時(shí)共同輸入供體間充質(zhì)干細(xì)胞可以降低移植失敗率并減輕GVHD。本實(shí)驗(yàn)擬將骨髓MSC輔助用于主要組織相容復(fù)合體(MHC)

2、半相合小鼠HSCT中，利用MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，探索不同數(shù)量的BMMSC在半相合HSCT中對(duì)aGVHD的影響，為減輕MHC不完全匹配HSCT中的aGVHD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 骨髓細(xì)胞及MSC供鼠清潔級(jí)C57BL/6<'H-2b>(B6)，6-8周齡，體重16.74±0.86克，雌雄兼用；受鼠清潔級(jí)CB6F1<'H-2b>(BALB/c<'H-2b>×C57BL/6<'H-2b>)，19.74±1

3、.75克，雌雄兼用，以上動(dòng)物由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于百級(jí)無(wú)菌層流架內(nèi)，飼料經(jīng)高壓處理后放入飼養(yǎng)箱。 2 BMMSC的分離培養(yǎng)將MSC供鼠(B6)斷椎處死后，無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，用含10％的胎牛血清的F12培養(yǎng)液沖出骨髓，常規(guī)制備骨髓MNC后置于一次性塑料培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO<,2>飽和濕度條件下培養(yǎng)。72小時(shí)后去除懸浮上清，換液。此后每3-4天換液一次，當(dāng)貼壁細(xì)胞層達(dá)到90％以上融合時(shí)，以0.25％胰酶

4、消化，傳至第3代以后的細(xì)胞，純度>90％用于移植。 3 建立MHC半相合移植動(dòng)物模型 3.1供鼠細(xì)胞的分離將供鼠(B6)斷椎處死后，立即浸入75％酒精浸泡2～3分鐘，無(wú)菌條件下分離脾臟、雙側(cè)股骨、脛骨。常規(guī)制備骨髓、脾臟MNC。錐蟲藍(lán)計(jì)數(shù)，拒染率>95％；調(diào)整細(xì)胞數(shù)待用。 3.2 T細(xì)胞檢測(cè)FCM法以mCD3-PE抗體測(cè)定脾MNC中T細(xì)胞含量。 3.3動(dòng)物分組①誘導(dǎo)GVHD組：CB6F1尾靜脈注入B6B

5、MMNC(3×10<'6>)+B6脾MNC1×10<'7>；0.4ml/只；②高劑量聯(lián)合MSC移植組：CB6F1尾靜脈注入B6BMMNC(3×10<'6>)+B6脾MNC1×10<'7>+B6BMMSCl×10<'6>；0.4ml/只；③低劑量聯(lián)合MSC移植組：CB6F1尾靜脈注入B6BMMNC(3×10<'6>)+B6脾MNC1×10<'7>+B6BMMSCl×10<'4>；0.4ml/只；TBI對(duì)照組：CB6F1尾靜脈注入生理鹽水0

6、.4ml/只。每組動(dòng)物6～8只(不包括在移植后不同時(shí)間活殺，留取血清標(biāo)本的動(dòng)物)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。 3.4移植動(dòng)物處理供受鼠均于移植前3天開始飲用鹽酸酸化水；受鼠于移植當(dāng)天接受<'60>Co Y射線致死性全身照射(TBI)12Gy，劑量率為6.3cGy/min，4小時(shí)內(nèi)按移植分組要求進(jìn)行細(xì)胞注射，-1d與移植后隔天測(cè)體重并由尾靜脈取血計(jì)數(shù)白細(xì)胞。于-1d、+7d、+21d、+42d摘眼球法取小鼠靜脈血，2000轉(zhuǎn)/分離心10分

7、鐘后分離血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。同時(shí)留取病理標(biāo)本。 4 aGVHD的判斷移植物植活：連續(xù)兩次WBC>1×10<'9>L<'-1>；移植失?。簞?dòng)物死亡時(shí)WBC≤1×10<'9>L<'-1>，或+15d后WBC≤1×10<'9>L<'-1>；WBC>1.5×10<'9>L<'-1>并伴有以下癥狀5種以上的定為GVHD：精神萎靡、翹毛、脫毛、皮損、腹瀉、弓背、眼炎、體重驟減甚至死亡。上述癥狀在+10d內(nèi)出現(xiàn)為超急性GVH

8、D；+10d～+60d出現(xiàn)為aGVHD。病理改變：肝細(xì)胞水腫伴有灶性壞死，匯管區(qū)及中央靜脈和肝血竇擴(kuò)張、淤血，肝竇及匯管區(qū)內(nèi)有較多的分葉核細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟結(jié)構(gòu)破壞，有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。 5 ELISA測(cè)定IL-6、IFN-Y取-1d、+7d、+21d、+42d血清測(cè)定，方法按使用說(shuō)明書要求。 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS11.5軟件分析，分組資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；繪制Kaplan-meier生存曲線。

9、 結(jié)果： 1 脾MNC中T細(xì)胞含量：約50％。 2 MSC對(duì)aGVHD的影響 2.1 MSC對(duì)動(dòng)物aGVHD出現(xiàn)的影響高劑量聯(lián)合移植組GVHD的出現(xiàn)時(shí)間較誘導(dǎo)GVHD模型組明顯延遲(41.75±6.25d&19.20±6.05d)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001；而低劑量聯(lián)合移植組GVHD的出現(xiàn)時(shí)間較誘導(dǎo)GVHD模型組明顯提前(8.13±2.30d&19.20±6.05d)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001。

10、2.2 MSC對(duì)aGVHD動(dòng)物生存期的影響高劑量聯(lián)合MSC移植組小鼠生存時(shí)間與GVHD組比較P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還不能認(rèn)為高劑量聯(lián)合移植可以延長(zhǎng)aGVHD動(dòng)物生存時(shí)間；低劑量聯(lián)合MSC移植組小鼠生存時(shí)間與GVHD組比較(19.58±2.21d＆34.19±6.82d)，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為低劑量聯(lián)合移植加速動(dòng)物死亡。 2.3 MSC對(duì)動(dòng)物體重的影響GVHD的發(fā)生伴隨著受鼠體重的下降，高劑量聯(lián)合移植組平均體重

11、下降至最低點(diǎn)的時(shí)間較GVHD組明顯延后(+28d＆+48d)，而單純照射和低劑量聯(lián)合移植組小鼠體重持續(xù)下降直至全部死亡。 2.4 MSC對(duì)動(dòng)物造血恢復(fù)的影響聯(lián)合MSC移植對(duì)細(xì)胞平均植入(外周血連續(xù)2天WBC>1×10<'9>L<'-1>)時(shí)間無(wú)明顯影響，在+6d全部小鼠WBC>1×10<'9>L<'-1>。 2.5病理觀察三組GVHD發(fā)生時(shí)的病理改變基本一致。 2.6 MSC對(duì)移植后血清IL-6、IFN-γ水平的

12、影響 2.6.1血清IL-6水平變化正常情況下血清IL-6水平較低(5±0.01pg/ml)，+7d高劑量MSC聯(lián)合移植組血清IL-6濃度較誘導(dǎo)GVHD組明顯升高(75±17.5＆25±10pg/ml)，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量MSC聯(lián)合移植組血清IL-6濃度較誘導(dǎo)GVHD組明顯減低(7.5±5＆25±10pg/ml)，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；到+21d、+42d時(shí)三組間IL-6水平無(wú)明顯差異。 2.

13、6.2血清IFN-γ水平變化正常小鼠血清IFN-γ濃度較低(2.5±0.01pg/ml)，+7d高劑量MSC聯(lián)合移植組血清IFN-γ濃度與誘導(dǎo)GVHD組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量MSC聯(lián)合移植組血清IFN-γ濃度較誘導(dǎo)GVHD組明顯升高(64±7.5&15±5pg/ml)，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；+21d高劑量聯(lián)合移植組血清IFN-γ水平較誘導(dǎo)GVHD組明顯低，P<0.001，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(80±6.7&265±6.5pg/ml)。