第三者骨髓間充質干細胞對MHC不相合造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病影響的實驗研究.pdf

1、目的：急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease，aGVHD)是異基因造血干細胞移植(allogenehematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)的主要障礙之一。骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMMSCs)是存在于骨髓中的非造血干細胞，能夠促進造血重建，減輕GVHD,在造血干細胞移植中發(fā)揮

2、免疫調節(jié)作用。由于其低免疫原性，而被認為是防治GVHD的新方法。為研究異基因造血干細胞移植時共同輸入供體或第三者間充質干細胞均可能減輕GVHD，本實驗利用純系小鼠C57BL/6H-2b→BAlB/cH-2d建立MHC不相合造血干細胞移植后aGVHD動物模型，將封閉群KM小鼠的BMMSCs經(jīng)體外培養(yǎng)后與供鼠的脾臟及骨髓細胞進行聯(lián)合移植，探討第三者來源的不同數(shù)量的BMMSCs在異基因造血干細胞移植中對aGVHD、移植后造血重建及免疫恢復的影

3、響。 方法： 1.實驗動物 清潔級造血干細胞供鼠C57BL/6H-2b(B6)，6～8周齡，雌雄兼用；受鼠BALB/cH-2d，6～8周齡，雌雄兼用；第三者BMMSCs供鼠：KMV小鼠，6～8周齡，雌雄兼用。以上動物由河北省實驗動物中心提供，合格證編號為803177。飼養(yǎng)于百級層流潔凈動物飼養(yǎng)柜。 2.BMMSCs的培養(yǎng)、擴增將BMMSCs供鼠頸椎脫臼處死，無菌分離小鼠股骨及脛骨，以含F(xiàn)12-DMEM為完

4、全培養(yǎng)基(CCM，含青霉素100μg/ml、鏈霉素100μg/ml、HEPES液0.03mol/L以及20％FBS)沖出骨髓。直接接種于25cm2一次性無菌塑料培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)。48小時后行首次半量換液，4天后進行全量換液，去除懸浮細胞，此后每3～4天換液一次，當貼壁細胞層達到90％以上融合時，以0.25％胰酶消化，傳至第3代以后的細胞，純度＞90％用于移植。 3.制備小鼠脾臟(spleen cells，

5、SPC)及骨髓細胞(bone marrowcells，BMC)取供鼠C57BL/6脫頸椎處死后，無菌分離脾臟、雙側股骨和脛骨。常規(guī)制備SPC及BMC懸液。錐蟲藍計數(shù)，拒染率＞95％，調整至所需細胞濃度備用。 4 建立MHC不相合移植動物模型供受鼠均于移植前3天開始飲用鹽酸酸化水；受鼠BALB/c于移植當天接受60Co Y射線致死性全身照射(total-body irradiation，TBI)10Gy，劑量率為0.63Gy/mi

6、n，4小時內按移植分組要求進行骨髓、脾淋巴細胞混合移植，移植量為：(BMC 5×106+SPC 1×107)B6/0.2ml/鼠，實驗組需同時輸注不同來源不同劑量的BMMSCs/0.2ml/鼠，對照組輸注生理鹽水/0.2ml/鼠。 5 動物分組 a 單純TBI組BALB/c+TBIb 異基因移植組BALB/c+TBI+(BMC+SPC)B6C 異基因移植+供者BMMSCs組BALB/c+TBI+(BMC+SPC)B6+M

7、SC B6(5×105)d 異基因移植+低劑量第三者BMMSCs組BALB/c+TBI+(BMC+SPC)B6+MSCKM(5×103)e 異基因移植+中劑量第三者BMMSCs組BALB/c+TBI+(BMC+SPC)B6+MSCKM(5×104)f 異基因移植+高劑量第三者BMMSCs組BALB/c+TBI+(BMC+SPC)B6+MSCKM(5×105)注：每組動物4～5只(不包括在移植后不同時間活殺，留取標本的動物)，每組實驗重復

8、2次。 6 結果判定 移植失?。簞游锼劳鰰rWBC≤1×109/L，或d+15后WBC≤1×109/L。GVHD：WBC＞1.5×109/L并伴有以下癥狀3種以上：精神萎靡、翹毛、脫毛、皮損、腹瀉、弓背、眼炎、體重驟減甚至死亡。上述癥狀在d+10內出現(xiàn)為超急性GVHD；d+10～d+30出現(xiàn)為aGVHD。生存期＞30天為長期生存。移植物植活：連續(xù)兩次WBC＞1×109/L。擇時取肺、肝、小腸進行病理檢查。 7 移植

9、動物觀察內容移植后每天觀察小鼠進食及精神狀況，稱量體重，記錄小鼠的存活時間。有無aGVHD的表現(xiàn)。隔日采集小鼠尾靜脈血，計數(shù)WBC數(shù)。在植入后第7天，取心臟血約0.3ml，應用流式細胞術檢測CD4+和CD8+細胞含量，計算CD4+/CD8+比值。取移植后7天的各組小鼠骨髓細胞，甲基纖維素半固體培養(yǎng)檢測CFU-GM生成率。 8 統(tǒng)計學分析SPSS 13.0軟件分析，分組資料以均數(shù)士標準差表示，進行t檢驗；繪制Kaplan-meie

10、r生存曲線。 結果： 1.第三者BMMSCs對造血重建的影響 1.1造血重建的時間所有移植組的外周血白細胞均于+3d達最低水平，且各組均成功植入。a、b、c、d、e、f各組植入時間為：0d、6.7±1.3d、5.0±0.7d、5.7±0.8d、4.8±1.2d、4.6±1.0d。c、d、e、f組與b組相比較，造血重建時間明顯縮短(P＜0.01)；c組與f組相比較造血重建時間無差別(P＞0.05)；d、e、f各組間

11、進行比較：d組與f組相比，造血重建時間有明顯差別(P＜0.01)；d、e組及e、f組間比較均無明顯差別(P＞0.05)。 1.2 CFU-GM集落計數(shù)a、b、c、d、e、f各組每孔CFU-GM集落計數(shù)為：0、23.0±2.0、60.9±2.2、23.4±3.1、49.6±2.3、60.1±3.0。c、e、f組與b組比較，CFU-GM集落計數(shù)明顯增加(P＜0.01)；d組與b組的CFU-GM集落計數(shù)比較無明顯差別(P＞0.05)。

12、d、e、f各組間進行比較，各組間均有明顯差別(P＜0.01)。 2.第三者BMMSCs對aGVHD發(fā)生的影響 2.1 aGVHD發(fā)生及生存時間進行異基因移植各組的小鼠的體重隨著GVHD的出現(xiàn)呈下降趨勢。b組于+3～+5d出現(xiàn)超急性GVHD的表現(xiàn)；c組和f組小鼠+9～+12d發(fā)生aGVHD，較b組出現(xiàn)時間明顯延遲，且GVHD程度較輕；d組小鼠出現(xiàn)aGVHD的時間約為+3～+5d；e組小鼠出現(xiàn)aGVHD的時間為+7～+9d。

13、a、b、c、d、e、f各組小鼠的生存時間為：8.5±1.0d、7.8±0.8d、22.3±4.1d、8.9±1.0d、14.9±1.6d、22.5±2.3d。c、d、e、f組與b組比較生存時間明顯延長(P＜0.05)；c組與f組相比較生存時間無差別(P＞0.05)；d、e、f各組間進行比較：各組間均有明顯差別(P＜0.01)。 2.2 病理組織學觀察各組GVHD發(fā)生時病理的基本變化一致。b組病變程度最為顯著：肺組織充血，肺泡腔出

14、血明顯；肝細胞水腫并伴有大片灶性壞死，匯管區(qū)及中央靜脈和肝血竇明顯擴張、淤血；小腸腺體及局部粘膜上皮壞死，腸腔內有大量脫落的壞死上皮細胞。c、d、e、f各組病變程度則明顯減輕，其各組間病理變化相似。 3.移植后免疫細胞恢復情況在植入后7天，存活的c、d、f組，其CD4+細胞分別為5.59％，7.85％，6.74％；CD8+細胞分別為14.37％，13.16％，15.19％。與正常小鼠比較(CD4:44.40％，CD8:10.26