第三者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)MHC不相合造血干細(xì)胞移植后移植物抗腫瘤作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是目前治愈惡性血液系統(tǒng)疾病最有效的手段之一。移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)是allo-HSCT后供者免疫細(xì)胞清除腫瘤細(xì)胞和防止復(fù)發(fā)的主要機(jī)制。GVHD和GVT作用常同時(shí)存在，在一些減輕GVHD的治療方法影響下，GVT作用也被削弱。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和造血干細(xì)胞(HSC)聯(lián)合移植能夠改善造血微環(huán)境促進(jìn)造血干細(xì)胞的植入，發(fā)揮有效的免疫抑制作用，減輕GVHD。本研究利用純系小鼠C57BL/6H-

2、2b→BALB/cH-2d建立MHC不相合造血干細(xì)胞移植荷瘤動(dòng)物模型，將封閉群KM小鼠骨髓MSC經(jīng)體外培養(yǎng)后與供鼠的脾臟及骨髓細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合移植，探討第三者來(lái)源的MSC在促進(jìn)MHC不相合HSCT后的造血重建、誘導(dǎo)免疫耐受同時(shí)，對(duì)GVT作用的影響。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)造血干細(xì)胞供鼠C57BL/6H-2b (B6)，6～8周齡，雌雄兼用；受鼠BALB/cH-2d，6～8周齡，雌雄兼用；第三者BMMSC供鼠，K

3、M小鼠，6～8周齡，雌雄兼用。以上動(dòng)物由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為803177。飼養(yǎng)于百級(jí)層流潔凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜。 2.BMMSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增將BMMSCs供鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌分離小鼠股骨及脛骨，以含F(xiàn)12-DMEM為完全培養(yǎng)基(CCM，含青霉素100μg/ml、鏈霉素100μg/ml、HEPES液0.03mol/L以及20％FBS)沖出骨髓。直接接種于25cm2一次性無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，

4、每48小時(shí)半量換液一次，換液兩次后，改為3-4天全量換液。當(dāng)貼壁細(xì)胞層達(dá)到90％以上融合時(shí)，以0.25％胰酶消化，傳至第3代以后的細(xì)胞，純度＞90％用于移植。 3.制備小鼠脾臟(SPC)及骨髓細(xì)胞(BMC)取B6小鼠脫頸椎處死后，無(wú)菌分離脾臟、雙側(cè)股骨和脛骨。常規(guī)制備SPC及BMC懸液，錐蟲(chóng)藍(lán)計(jì)數(shù)，拒染率＞95％，調(diào)整至所需細(xì)胞濃度備用。 4 B16細(xì)胞的體內(nèi)傳代小鼠黑色素細(xì)胞瘤B16購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。常規(guī)培

5、養(yǎng)傳代后，制備1×107/ml細(xì)胞懸液，接種于BALB/c小鼠右前腋下，每鼠約1 × 106細(xì)胞，在移植當(dāng)天無(wú)菌條件下取出腫瘤塊，并制得單細(xì)胞懸液，錐蟲(chóng)藍(lán)計(jì)數(shù)，拒染率＞95％；調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10 7/ml備用。 5 MHC不相合造血干細(xì)胞移植荷瘤動(dòng)物模型的建立供受鼠均于移植前3天開(kāi)始飲用酸化水。將研磨制得的小鼠B16細(xì)胞接種于受鼠BALB/c右前腋下，0.1ml/鼠(1×10 6細(xì)胞)，24小時(shí)后接受60Coγ射線(xiàn)亞致死性全

6、身照射(TBI)8.5Gy,，劑量率0.63Gy/min，預(yù)處理后4小時(shí)內(nèi)接受(BMC 5 × 106+SPC 1 × 107)B6/0.2ml/鼠，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)輸注不同數(shù)量的BMMSCKM/B6，對(duì)照組輸注生理鹽水/0.2ml/鼠。 6 動(dòng)物分組 a.低數(shù)量第三者M(jìn)SC移植組： B16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 103)→BALB/cb.中數(shù)量第三者M(jìn)SC移植組： B 16+

7、TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 104)→BALB/cc.高數(shù)量第三者M(jìn)SC移植組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCKM(5 × 105)→BALB/cd.高數(shù)量供鼠MSC移植對(duì)照組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6+BMMSCB6(5 × 105)→BALB/ce.無(wú)MSC移植組： B 16+TBI+(BMC+SPC)B6→BALB/cf. 單純TBI對(duì)照

8、組： TBI→BALB/cg.TBI+B16對(duì)照組： B 16+TBI→BALB/ch.B16成瘤對(duì)照組： B16→BALB/c注：每組動(dòng)物4～5只(不包括在移植后不同時(shí)間活殺，留取標(biāo)本的動(dòng)物)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。 7 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 7.1移植失敗：動(dòng)物死亡時(shí)WBC≤1×109/L，或者移植15天后WBC≤1.5×109/L。 7.2 GVHD判斷：WBC＞1.0×109/L并伴有以下癥狀

9、3種以上的動(dòng)物定為GVHD：精神萎靡，翹毛，脫毛，皮損，腹瀉，弓背，眼炎，體重驟減甚至死亡；d+10天內(nèi)出現(xiàn)癥狀者為超急性GVHD(saGVHD)：d+10～d+30天出現(xiàn)者為aGVHD。 7.3 腫瘤導(dǎo)致死亡的判斷：動(dòng)物死亡時(shí)WBC＞1.5×109/L，腫瘤明顯增大，破潰壞死，無(wú)明顯GVHD表現(xiàn)。 7.4 長(zhǎng)期生存：生存時(shí)間大于30天記為長(zhǎng)期生存。若生存期大于60天按60天計(jì)算。 8 移植動(dòng)物觀(guān)察內(nèi)容移植后每天

10、觀(guān)察小鼠進(jìn)食及精神的狀況，有無(wú)aGVHD的表現(xiàn)；每天稱(chēng)量體重；可觸及的腫瘤出現(xiàn)為腫瘤出現(xiàn)時(shí)間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大?。挥涗浶∈蟮拇婊顣r(shí)間及原因。隔日采集小鼠尾靜脈血，計(jì)數(shù)WBC數(shù)。擇時(shí)取小鼠的肺、肝、小腸進(jìn)行病理學(xué)檢查，并觀(guān)察變化和差異。 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用X±SD表示，多個(gè)樣本兩兩比較采用q檢驗(yàn)(SNK法)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)。