大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原-透明質(zhì)酸支架成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨損傷后有限的自身修復(fù)能力及其對(duì)人體功能的嚴(yán)重影響，使其成為骨科基礎(chǔ)和臨床研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)課題，目前尚未得到很好的解決。傳統(tǒng)的治療如微骨折、磨削成形術(shù)、骨膜軟骨膜移植、骨軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換等均存在一定的不足。近年來(lái)組織工程的發(fā)展有望成為治療軟骨損傷的新方法。組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，對(duì)病損組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)與重建進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)的一門(mén)新興學(xué)科。與胚胎干細(xì)胞、基因工程一起被認(rèn)為是生命科學(xué)發(fā)展史上的又一個(gè)里程碑，標(biāo)志

2、著人類(lèi)將走出單純器官移植領(lǐng)域，步入組織、器官再造的新領(lǐng)域。但目前組織工程軟骨應(yīng)用急需解決的問(wèn)題有：①具有較強(qiáng)增殖能力和多分化潛能的細(xì)胞；②合適的細(xì)胞載體；基于以上要求，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以下三部分實(shí)驗(yàn)的研究。 第一章大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究 目的:掌握大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并探討其部分生物學(xué)特性。 方法:無(wú)菌技術(shù)下切取大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊，加入適量I型膠原酶消

3、化獲取細(xì)胞，接種入含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取傳代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)表面抗原標(biāo)志CD29、CD34、CD44。MTT法測(cè)定第2、5、10代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。并測(cè)定細(xì)胞的貼壁率。 結(jié)論:從大鼠脂肪中分離的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，能長(zhǎng)期培養(yǎng)，生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖較快，可以作為組織工程的種子細(xì)胞。 第二章大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討AD

4、MSCs向成軟骨方向分化的條件，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 方法:按照第一章實(shí)驗(yàn)方法分離培養(yǎng)細(xì)胞。取第5代細(xì)胞，分別以1×10<'7>／mL和5×10<'6>／mL的細(xì)胞密度行“micromaSS”法接種，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-βl+6.25μg／mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.25μg／mL胰島素。部分培養(yǎng)孔中加入0.1nmol／mL地塞米松，于誘導(dǎo)培養(yǎng)2w時(shí)進(jìn)行阿爾新蘭和甲苯胺藍(lán)染色以及Ⅱ型膠原免

5、疫細(xì)胞化學(xué)染色。于誘導(dǎo)培養(yǎng)7d、14d用RT-PCR鑒定II型膠原mRNA表達(dá)。 結(jié)論:大鼠ADMSCs在新生牛血清、TGF-βl、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素的作用下可以向成軟骨細(xì)胞分化，而且以1×10<'7>／mL的細(xì)胞密度誘導(dǎo)培養(yǎng)成軟骨能力要高于5×10<'6>／mL。地塞米松可以加速其成軟骨分化。 第三章大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原／透明質(zhì)酸支架成軟骨分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討大鼠脂肪ADMSCs在膠原／透明質(zhì)酸三維

6、支架上培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)分化成軟骨的能力。 方法:按照第一章實(shí)驗(yàn)方法分離培養(yǎng)細(xì)胞。取第5代細(xì)胞，以1×10<'7>／mL的細(xì)胞密度接種于膠原海綿／透明質(zhì)酸支架上，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，即1％新生牛血清+1ng／mL的TGF-β1+6.25μg／mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+6.25μg／mL胰島素+O.1nmol／mL地塞米松。于培養(yǎng)3周時(shí)將支架制備成石蠟切片分別進(jìn)行HE染色、阿爾新蘭染色、加苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)進(jìn)行RT