骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物支架材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損實驗研究.pdf

1、目的: 1探討體外提取分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的方法。 2尋求更好的關(guān)節(jié)軟骨生物支架材料，使其在孔隙率，比表面積，彈性模量等物理特性和細(xì)胞毒性、溶血試驗、生物降解性等生物相容性方面更接近天然軟骨支架材料的要求。 3探討異種異體脫細(xì)胞軟骨支架材料(acellular cartilage material，ACM)復(fù)合同種異體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rabbit bone marrow-derived me

2、senchymal stem cells，rBMSC)修復(fù)兔股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。 方法: 1采用密度梯度離心和差速貼壁法獲得兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及生長狀態(tài)，細(xì)胞計數(shù)板下對第1、3、5代細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞表面抗原標(biāo)記對其進行純度分析。 2①將豬膝關(guān)節(jié)軟骨凍干加工為粉末，胰酶消化，曲拉通洗脫，蒸餾水洗凈凍干，紫外線照射(UVI)后成型。電鏡觀察孔徑分布，壓汞儀測定孔隙率等參

3、數(shù)；②細(xì)胞毒性測定：材料浸提液培養(yǎng)細(xì)胞進行細(xì)胞形態(tài)大體觀察，MTT法觀察細(xì)胞活性；③急性全身毒性反應(yīng)：材料浸提液注射入SD大鼠腹腔觀察材料對動物表現(xiàn)及體重變化的影響；④溶血試驗：材料浸提液與稀釋動物鮮血混合觀察紅細(xì)胞溶解情況，492nm下檢測OD值計算相對溶血率；⑤觀察細(xì)胞復(fù)合材料共培養(yǎng)情況并將材料埋植于動物皮下檢測材料的生物降解性。 3①密度梯度離心和差速貼壁法獲得原代兔BMSC。選擇第三代BMSC作為種子細(xì)胞；②利用冷凍干燥

4、、胰酶消化和化學(xué)去垢劑等方法制備脫細(xì)胞軟骨支架材料；③3月齡新西蘭兔內(nèi)髁制備直徑4mm，深3mm.動物關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，24只新西蘭兔以2個時間段隨機分為3組，Ⅰ ACM-BMSC組：第三代BMSC 1×106個/mL與ACM于37℃、5％CO2飽和濕度復(fù)合48h；ⅡACM組；Ⅲ空白對照組；④移植6，12周后大體及組織學(xué)觀察，免疫組化染色觀察修復(fù)組織Ⅱ型膠原，Wakitani評分評估修復(fù)效果。 結(jié)果: 1原代培養(yǎng)的BMS

5、C呈圓形、梭形、多角形等，48h可見貼壁細(xì)胞有伸展現(xiàn)象，呈梭形，多角形，成纖維細(xì)胞樣展開，細(xì)胞核清晰，14d左右可達90％融合；1、3、5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線：細(xì)胞貼壁48h增殖緩慢，處于潛伏期；對數(shù)增殖期為3～4d，第6d后進入平臺期；，③第2代BMSC CD44表達陽性，標(biāo)記率為93.0％。 2①脫細(xì)胞生物支架材料為白色，略微發(fā)黃，外表呈多孔疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。脆性大，有一定的彈性?？紫堵蕿?8.54％，平均孔徑為47.1

6、3岬；②細(xì)胞毒性試驗：24h、48h、72h各時間段內(nèi)三組細(xì)胞OD值兩兩比較(P>0.05)，無顯著差異,ACM細(xì)胞毒性為0級；③動物急性毒性實驗：Ⅰ生物材料處理組和Ⅱ生理鹽水處理組對動物體重影響沒有差異(P>0.05)，Ⅰ生物材料處理組和Ⅲ苯酚處理組對動物體重有顯著差異(P<0.05)；④溶血試驗：材料的相對溶血率為2.92％，低于5％的標(biāo)準(zhǔn)，沒有明顯溶血現(xiàn)象；⑤材料直接接觸試驗：細(xì)胞嵌入軟骨支架材料中，細(xì)胞成圓形和橢圓形，部分細(xì)胞可

7、見細(xì)胞核，材料成顆粒狀，染色均一；動物皮下埋植：組織學(xué)觀察可見試樣周圍存在少量淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，致密纖維囊壁將復(fù)合細(xì)胞的材料包裹，材料被降解為細(xì)小顆粒，細(xì)胞均勻散在材料中成橢圓形，可見分裂相。 3①大體觀察及組織學(xué)觀察：6和12周ⅠACM-BMSC組再生組織與正常關(guān)節(jié)軟骨面平齊，修復(fù)部位表面較平整，界限模糊，接近正常軟骨。Ⅱ ACM組修復(fù)組織表面不平整并有明顯下陷，修復(fù)組織全層可見成纖維樣細(xì)胞，深層可見極少數(shù)透明軟骨樣細(xì)胞

8、。Ⅲ空白曠置組未見明顯修復(fù)，肉芽組織形成伴成纖維樣細(xì)胞增生；②Wakitani組織學(xué)評分可見在不同的時間段內(nèi)Ⅰ和Ⅱ組均低于Ⅲ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅰ和Ⅱ組間組織學(xué)評分統(tǒng)計學(xué)無顯著差異(P>0.05)；③免疫組織化學(xué)： ACM.BMSC組修復(fù)組織的細(xì)胞為軟骨樣細(xì)胞，可見柱狀排列，周圍軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原染色陽性。 結(jié)論: 1依據(jù)實驗方法，BMSC可以較快良好的生長，且純度較高，為BMSC的研究提供方便的提取和培