褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠牙乳頭細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、褪黑素(melatonin,MT)是一種吲哚胺類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在人和哺乳動(dòng)物主要由松果體分泌，接受中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦視交叉神經(jīng)上核(Suprachiasmatic Nuclei，SCN)的調(diào)控。SCN-松果體-MT系統(tǒng)主要調(diào)控機(jī)體的生物節(jié)律，以往研究發(fā)現(xiàn)SCN參與調(diào)控牙本質(zhì)的節(jié)律性形成；也有學(xué)者提出巨牙癥可能與松果體肥大及褪黑素分泌異常有關(guān)；最新研究發(fā)現(xiàn)成釉器細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)褪黑素受體MT1。褪黑素是否參與牙齒的發(fā)育值得探討。褪

2、黑素的生物學(xué)作用廣泛，除調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律外，還可抗氧化、抗衰老，抗腫瘤，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)免疫力等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)褪黑素具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，能夠促進(jìn)骨質(zhì)形成、骨折愈合及牙種植體周圍的骨整合；體外可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。因此，褪黑素可能是除甲狀旁腺素外又一與鈣調(diào)節(jié)有關(guān)的激素。牙本質(zhì)的形成與骨質(zhì)相似，均為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌及羥基磷灰石沉積的過(guò)程，因此我們推測(cè)褪黑素在牙本質(zhì)形成過(guò)程中也可能起作用。牙乳頭細(xì)胞(DPC

3、s)是未分化的外胚間充質(zhì)細(xì)胞，是牙髓細(xì)胞與成牙本質(zhì)細(xì)胞共同的前體細(xì)胞，參與牙本質(zhì)的形成及修復(fù)過(guò)程，在牙齒發(fā)育及牙髓損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠牙乳頭細(xì)胞(ratdental papilla cells，RDPCs)，觀察褪黑素受體MT1、MT2在RDPCs中的表達(dá)分布，研究褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)RDPCs增殖、分化的影響，并進(jìn)一步觀察MT受體拮抗劑Luzindole對(duì)MT作用的影響，初步探討其作用機(jī)制。
　　 目的：

4、檢測(cè)體外培養(yǎng)RDPCs是否表達(dá)褪黑素受體MT1、MT2；研究生理濃度褪黑素對(duì)RDPCs增殖、分化的影響，并進(jìn)一步觀察MT受體拮抗劑對(duì)其作用的影響，初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：⑴SD大鼠牙乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)：采用組織塊法分離培養(yǎng)新生1天SD大鼠下頜第一磨牙牙乳頭細(xì)胞，差別消化法純化細(xì)胞。⑵免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)褪黑素受體MT1、MT2在RDPCs中的表達(dá)分布。⑶MTT比色法檢測(cè)生理濃度褪黑素對(duì)RDPCs增殖的影響：①檢測(cè)普通培

5、養(yǎng)條件下，不同生理濃度褪黑素：10-12mol/L(低濃度組)、10-10mol/L(中濃度組)、10-8mol/L(高濃度組)，在作用24h、48h、72h、96h后各組RDPCs的OD490nm值，并計(jì)算各組RDPCs的增殖率。對(duì)照組不加褪黑素。②在礦化誘導(dǎo)條件下檢測(cè)褪黑素對(duì)RDPCs增殖的影響，檢測(cè)指標(biāo)同上。③在以上兩種條件下，中濃度組加入褪黑素受體拮抗劑2μmol/L Luzindole，72h、96h后檢測(cè)兩組OD490nm值

6、有無(wú)變化。⑷RDPCs分化實(shí)驗(yàn)：①ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度褪黑素作用3天后，各組RDPCs的ALP活性(OD520nm值)。并在高濃度組加褪黑素受體拮抗劑Luzindole(2μmol/L)，觀察OD520nm值有無(wú)變化。②免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)MT(10-8mol/L)對(duì)RDPCs DSP表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)分為普通培養(yǎng)組、礦化誘導(dǎo)組、褪黑素組、陰性對(duì)照組(PBS替代一抗)。按實(shí)驗(yàn)分組加藥7天后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)DSP的表達(dá)。③Vo

7、nkossa和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色檢測(cè)MT(10-8mol/L)對(duì)RDPCs體外礦化結(jié)節(jié)形成的影響：實(shí)驗(yàn)分為普通培養(yǎng)組、礦化誘導(dǎo)組、褪黑素組。按實(shí)驗(yàn)分組誘導(dǎo)21天后，分別進(jìn)行Vonkossa和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。茜素紅染色后，1％鹽酸酒精處理5min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組OD450nm值。
　　 結(jié)果：⑴組織塊法及差別消化法可得到純化的牙乳頭細(xì)胞。⑵RDPCs表達(dá)褪黑素受體MT1，不表達(dá)MT2。⑶RDPCs增殖實(shí)驗(yàn)：①普通培養(yǎng)條件下加藥

8、24h，各組細(xì)胞間的增殖率無(wú)明顯差異；48h后，高濃度組低于其它三組(p＜0.05)；72h后，中、高濃度組低于對(duì)照組及低濃度組(p＜0.05)；96h后，實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組(p＜0.05)，且高濃度組低于中、低濃度組。②礦化誘導(dǎo)條件下，在所有時(shí)間點(diǎn)，中、高濃度組增殖率均低于對(duì)照組及低濃度組(p＜0.05)；72h后，低濃度組增殖率有下降趨勢(shì)；96h后，低濃度組明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)。③在以上兩種培養(yǎng)條件下，中濃度組中加入褪黑素

9、受體拮抗劑后，增殖率無(wú)明顯變化(p＞0.05)。⑷RDPCs分化實(shí)驗(yàn)：①ALP活性檢測(cè)：高濃度組OD值高于對(duì)照組(p＜0.05)，加入拮抗劑Luzindole后，OD值變化不明顯(p＞0.05)。②DSP免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：普通培養(yǎng)組染色陰性，礦化誘導(dǎo)組染色弱陽(yáng)性，褪黑素組染色強(qiáng)陽(yáng)性。③Vonkossa染色：礦化誘導(dǎo)組與10-8mol/L褪黑素組均可見紅色結(jié)節(jié)染色，普通培養(yǎng)組無(wú)明顯結(jié)節(jié)形成；茜素紅染色，兩實(shí)驗(yàn)組OD值均高于對(duì)照組(p＜

10、0.05)，但實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法體外成功培養(yǎng)了大鼠牙乳頭細(xì)胞，并用差別消化法獲得了純化大鼠牙乳頭細(xì)胞。②普通培養(yǎng)及礦化誘導(dǎo)條件下生理濃度的褪黑素均可抑制大鼠牙乳頭細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性。③褪黑素可增強(qiáng)大鼠牙乳頭細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)大鼠牙乳頭細(xì)胞DSP表達(dá)，為進(jìn)一步研究褪黑素促進(jìn)大鼠牙乳頭細(xì)胞分化提供依據(jù)。④大鼠牙乳頭細(xì)胞表面表達(dá)褪黑素受體MT1，但褪黑素受體拮抗劑不影響其作用