鹽酸法舒地爾對(duì)體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、背景
　　 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,神經(jīng)細(xì)胞是一種終末細(xì)胞,缺乏再生能力,神經(jīng)細(xì)胞的產(chǎn)生僅限于胚胎和出生后的短暫時(shí)期內(nèi),當(dāng)中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)因缺血、創(chuàng)傷、變性等疾病造成神經(jīng)細(xì)胞損傷后,神經(jīng)細(xì)胞很難建立新的突觸聯(lián)系,以至損傷后神經(jīng)功能難于恢復(fù)。近來(lái)研究表明,無(wú)論是在胚胎期還是在成年期,哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)均含有自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞,神經(jīng)干細(xì)胞替代治療為神經(jīng)系統(tǒng)損傷、變性疾病的患者帶來(lái)了希望。但是目前尚無(wú)法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分

2、化與遷移進(jìn)行有效控制,使其到達(dá)損傷區(qū)域,定向分化為特定的神經(jīng)細(xì)胞亞型,而且損傷部位周圍抑制因子的存在,阻止神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,促使其更多的向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化,形成膠質(zhì)瘢痕,影響神經(jīng)功能的修復(fù)。因此神經(jīng)干細(xì)胞的分化、增殖和遷移的機(jī)制是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。RhoA是細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的重要調(diào)節(jié)分子,Rho激酶?jìng)鲗?dǎo)通路對(duì)細(xì)胞的分裂粘附、細(xì)胞分化遷移細(xì)、胞骨架調(diào)整、肌肉細(xì)胞收縮、腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)等活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。近來(lái)研究表明多種

3、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展與Rho激酶信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān),抑制Rho激酶活性可有效預(yù)防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,Rho激酶抑制劑也成為神經(jīng)系統(tǒng)新藥研究的靶點(diǎn)之一。鹽酸法舒地爾(六氫-1-(5-異喹啉基磺酰基)-1H-1,4-二氮環(huán)庚烷,Fasudil,又名HA1077)是臨床上常用的RhoA激酶抑制劑,廣泛應(yīng)用于腦血管病治療。本研究旨在觀察鹽酸法舒地爾對(duì)體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響,是否可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化,這對(duì)于研究神

4、經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和變性疾病具有重要的意義。
　　 目的
　　 1.分離和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2.觀察鹽酸法舒地爾對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：
　　 1.以新生24h內(nèi)的Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用懸浮培養(yǎng)的方法從新生大鼠腦組織中提取神經(jīng)干細(xì)胞,并進(jìn)行傳代培養(yǎng)和干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn),采用免疫熒光法行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin、神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記蛋白NSE和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)

5、記蛋白GFAP染色,鑒定神經(jīng)干細(xì)胞及其自然貼壁分化后細(xì)胞表達(dá)的表面抗原。
　　 2.取培養(yǎng)第三代的神經(jīng)干細(xì)胞克隆,分別加入終濃度為50μmol/L,100μmol/L和200μmol/L的鹽酸法舒地爾為實(shí)驗(yàn)組,不加入鹽酸法舒地爾的為對(duì)照組,干預(yù)30min后,然后更換神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞分化后的細(xì)胞形態(tài)。
　　 3.采用免疫化學(xué)染色,觀察分化后細(xì)胞的NSE、GFAP表達(dá)情況,雙盲法計(jì)算各

6、組中陽(yáng)性細(xì)胞比例,并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組中NSE陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　 4.采用AO、EB染色法和LDH活性測(cè)定的方法,檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化后細(xì)胞的存活率。
　　 結(jié)果：
　　 1.從新生大鼠大腦分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有自我更新和分化能力,神經(jīng)球免疫化學(xué)染色Nestin陽(yáng)性,其分化的細(xì)胞可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物NSE、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP。
　　 2.倒置顯微鏡下觀察,與對(duì)照組相比,鹽酸法舒地爾組分化出更多的

7、神經(jīng)元樣細(xì)胞,且實(shí)驗(yàn)組免疫組化染色為NSE陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組中NSE陽(yáng)性細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組分化出更多的NSE陽(yáng)性細(xì)胞,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雖然隨著鹽酸法舒地爾濃度的增高,神經(jīng)球分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目具有增多趨勢(shì),但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.AO、EB染色:倒置顯微鏡下觀察鹽酸法舒地爾組大部分細(xì)

8、胞形態(tài)飽滿,細(xì)胞質(zhì)呈綠色,核染色為亮綠色,核形態(tài)規(guī)則,為圓形或橢圓形,僅有少量細(xì)胞核呈桔紅色；而對(duì)照組胞核紅染細(xì)胞數(shù)目較實(shí)驗(yàn)組明顯增多；LDH活性檢測(cè)證明,神經(jīng)干細(xì)胞分化從第2d開始,對(duì)照組LDH活性較實(shí)驗(yàn)組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功分離出神經(jīng)干細(xì)胞,并在體外擴(kuò)增、傳代,誘導(dǎo)分化后形成神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,二者免疫熒光染色分別呈NSE和GFAP陽(yáng)性。