無血清神經(jīng)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠骨髓源性神經(jīng)干細胞的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 擬利用無血清神經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)細胞分化為骨髓源性神經(jīng)干細胞，初步鑒定其具有神經(jīng)干細胞的生物特性。并探索骨髓源性神經(jīng)干細胞凍存條件，為進一步基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 抽取大鼠股骨和脛骨的骨髓，通過全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。以流式細胞儀檢測細胞周期及細胞免疫表型，油紅0染色及茜素紅染色鑒定其成骨、成脂能力。利用含表皮生長因子、堿性成纖維生長因子、B2

2、7的DMEM/F12培養(yǎng)基，將4～6代的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)向骨髓源性神經(jīng)干細胞分化。觀察誘導(dǎo)后的細胞形態(tài)及生長情況，通過免疫熒光染色及RT-PCR技術(shù)檢測神經(jīng)干細胞的特異性標(biāo)志物的巢蛋白的表達情況。在含有10％血清的培養(yǎng)液中進一步分化鑒定其向神經(jīng)細胞分化的能力。檢測凍存復(fù)蘇后細胞的存活及增殖情況，以比較四種不同條件下凍存細胞的效果。
　　 [結(jié)果]
　　 P5骨髓間充質(zhì)干細胞處于G1期占91.5±3.1％，高表達C

3、D90及CD29，不表達CD45及CD34，成脂誘導(dǎo)后在胞質(zhì)中可見桔紅色脂滴，成骨誘導(dǎo)后可見黑色礦化結(jié)節(jié)。在無血清培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)出的骨髓源性神經(jīng)干細胞巢蛋白免疫熒光染色呈陽性，流式細胞儀檢測其陽性率為97.24±1.1％。在含有血清的培養(yǎng)基中貼壁生長7天后，行熒光免疫檢測NSE，β-Tubulin，GFAP及MAP-2抗原免疫熒光染色均呈陽性表達。凍存復(fù)蘇后的NSC能夠存活、增殖，并能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。四個凍存

4、組存活率在40.5～52.1％之間，四組存活率均數(shù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以C組存活率最高為52.1±2.2％。四種凍存液凍存效果之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。C組DMEM/F12：BSA：DMSO=5:4:1的復(fù)蘇后存活細胞一周生長增殖較其他三組好。
　　 [結(jié)論]
　　 ①本實驗采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSC，通過細胞的形態(tài)、表型及向脂肪細胞及成骨細胞分化特性證實為培養(yǎng)的細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞。②本實驗將骨髓間充

5、質(zhì)細胞在無血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出能夠存活并增殖的神經(jīng)干細胞群體，其形態(tài)神經(jīng)球，并表達神經(jīng)細胞特異性標(biāo)記蛋白Nestin。③在體外含有10％血清的條件下，骨髓源神經(jīng)干細胞能分化為NSE陽性的神經(jīng)元、GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞、MBP2陽性的少突膠質(zhì)細胞，表明誘導(dǎo)后形成的細胞球具有分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)三種主要細胞的能力。④凍存后的骨髓源性神經(jīng)干細胞能夠存活、增值，仍具有分化能力。凍存條件C組DMEM/F12：BSA：DMSO=5:4:1凍存效果